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龙图腾网获悉浙江理工大学申请的专利一种根癌农杆菌介导的蝉花虫草真菌基因敲除方法获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN115873887B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-07-25发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202211383895.2，技术领域涉及：C12N15/80；该发明授权一种根癌农杆菌介导的蝉花虫草真菌基因敲除方法是由张静雅;曾国红;张瑾;吴巧云;赵洪新设计研发完成，并于2022-11-07向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种根癌农杆菌介导的蝉花虫草真菌基因敲除方法在说明书摘要公布了：本发明属于生物技术领域，具体涉及应用根癌农杆菌介导的蝉花真菌中的基因敲除遗传转化方法。本发明公开了一种目标基因beas的敲除载体的构建，本发明还同时公开了利用根癌农杆菌介导敲除蝉花虫草菌基因的方法。本发明利用分子生物学方法敲除蝉花虫草真菌中白僵菌素的关键合成基因，使利用该菌株培养24天后收获的菌体中白僵菌素不表达或含量极低。敲除白僵菌素的关键合成基因后的菌株具有不产白僵菌素的遗传稳定性。为针对不产生白僵菌素的蝉花虫草真菌的新药开发提供基础。

本发明授权一种根癌农杆菌介导的蝉花虫草真菌基因敲除方法在权利要求书中公布了：1.利用根癌农杆菌介导敲除蝉花虫草菌基因的方法，其特征在于包括以下步骤： 一、目标基因beas的敲除载体5’-pPK2-bar-GFP-3’的构建，包括以下步骤： 1）、beas基因上下游组合片段基因的获取： 从虫草菌的野生型基因组中扩增得到作为目的基因的beas基因的开放阅读框上下游片段；beas基因上游组合片段序列如SEQIDNO:2所述，beas基因下游组合片段序列如SEQIDNO:3所述； 2）、步骤1）所得的beas基因上游组合片段序列、beas基因下游组合片段序列与质粒pPK2-bar-GFP重组；重组产物转化于Eco.liDH5α感受态细胞中，得到目标基因beas的敲除载体5’-pPK2-bar-GFP-3’； 二、将5’-pPK2-bar-GFP-3’转入根癌农杆菌中，得工程菌；所述工程菌进行真菌的遗传转化，得农杆菌AGL1阳性单菌落； 三、真菌活化培养： 于PDA平板上取虫草菌菌液划板活化蝉花虫草菌，制取孢子悬液； 四、工程菌活化培养： 将步骤二所得的农杆菌AGL1阳性单菌落，接种到含相应抗生素的LB液体培养基中培养到一定浓度，得到工程菌液；用含有抗生素和乙酰丁香酮的IMAS液体培养基中黑暗震荡培养，获取侵染液； 五、农杆菌侵染和共培养： 将步骤四所得的侵染液与步骤三所得的孢子悬液1：1混合，共培养于含相应抗生素的固体诱导培养基上，直至其长出白色绒毛状菌丝； 六、分化筛选： 将步骤五中长出的白色绒毛状菌丝转移到筛选培养基上,接着在此基础上再倒入含有相应抗生素的筛选培养基形成三明治模型，继续培养，直至其长出白色簇状绒毛； 七、二次筛选： 将步骤六长出的转化子挑取到含相应抗生素的M-100筛选培养基上进行二次筛选，筛选出可能的阳性转化子，并将其转移到PDA培养基上，继续培养，直至长出菌株； 八：运用两步PCR验证，得到阳性突变菌株。

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