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龙图腾网获悉北京百力格生物科技有限公司申请的专利利用级联放大检测靶基因中SNP位点基因型的方法及其试剂盒获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN119842888B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-07-29发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202510347474.1，技术领域涉及：C12Q1/6883；该发明授权利用级联放大检测靶基因中SNP位点基因型的方法及其试剂盒是由佟宗轩;李俊;莫瑞瑞设计研发完成，并于2025-03-24向国家知识产权局提交的专利申请。

本利用级联放大检测靶基因中SNP位点基因型的方法及其试剂盒在说明书摘要公布了：本发明提供利用级联放大检测靶基因中SNP位点基因型的方法及其试剂盒，所述方法包括针对含有待测SNP位点的靶基因设计第一引物、第二引物和媒介探针，根据所述媒介探针的媒介序列设计放大探针，根据放大探针的单链报告序列设计检测探针，在含有所述上游第一引物、第二引物、媒介探针、放大探针、检测探针、含有所述靶基因的核酸样品和DNA聚合酶反应体系中，进行PCR扩增和扩增产物的分析。本发明的方法是一种非靶标依赖的检测方法，通过在熔解曲线分析中检测具有某一种双链体的熔点的熔解峰，可判断与该双链体对应的靶基因SNP分型，本发明经过PCR扩增以及媒介引物与放大探针结合两次PCR指数扩增的优势，可以富集大量的靶核酸，提高检测灵敏度。

本发明授权利用级联放大检测靶基因中SNP位点基因型的方法及其试剂盒在权利要求书中公布了：1.非诊断目的的利用级联放大检测靶基因中SNP位点基因型的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： 步骤1：针对含有待测SNP位点的靶基因设计第一引物、第二引物和媒介探针， 1.1.所述第一引物和第二引物与所述靶基因特异性结合，用于扩增含有所述待测SNP位点的靶基因； 1.2.所述媒介探针从5’端至3’端方向依次包含媒介序列和靶基因特异性结合序列，其中所述媒介序列不能与靶基因结合；所述靶基因特异性结合序列与所述靶基因能够特异性互补结合，且沿着5’端至3’端方向，靶基因特异性结合序列的第一个碱基序列对应于所述靶基因的SNP位点，所述第一个碱基序列与所述靶基因的SNP位点的野生型碱基或突变型碱基互补；媒介探针的3’端标记有阻止延伸的基团； 步骤2：根据步骤一所述媒介探针的媒介序列设计放大探针，所述放大探针顺序地包括单链报告序列、双链辅助序列和单链媒介序列特异性结合序列，所述单链报告序列不与所述靶基因结合，所述单链报告序列不与所述放大探针中其它序列互补配对；所述辅助序列的双链结构在PCR扩增过程中保持稳定；所述媒介序列特异性结合序列与所述媒介探针中的媒介序列特异性互补结合，且所述媒介序列与所述媒介序列特异性结合序列结合后形成的双链正好与所述辅助序列的双链平齐，即上述二个双链之间没有间隔碱基；所述单链媒介序列特异性结合序列的末端标记有阻止延伸的基团； 步骤3：根据所述放大探针的单链报告序列设计检测探针，所述检测探针依次包含有与所述放大探针的单链报告序列的互补序列、所述辅助序列5’端的第一个碱基互补的碱基和一个延伸序列，所述延伸序列，沿3’端至5’端方向，第一个碱基不能与辅助序列沿5’端至3’端方向第二个碱基互补； 步骤4：在含有所述第一引物、第二引物、媒介探针、放大探针、检测探针、含有所述靶基因的核酸样品和DNA聚合酶反应体系中，进行PCR扩增和扩增产物的分析： 4.1.当所述靶基因特异性结合序列的第一个碱基是与所述靶基因SNP位点的野生型碱基互补时： 4.1.1.若所述靶基因SNP位点为野生型时，此时，所述媒介探针中所述靶基因特异性结合序列的第一个碱基与野生型靶基因互补结合形成SNP位点碱基对，所述第一引物和第二引物均进行延伸扩增，沿5’端至3’端延伸至所述媒介探针中媒介序列的最后一个碱基时，DNA聚合酶将切割所述SNP位点碱基对与其相邻第一个碱基对之间的磷酸二酯键，切割下来的序列片段包含媒介序列及所述第一个碱基，将该片段称为第一媒介引物，该媒介引物与所述放大探针的单链媒介序列特异性结合序列特异性结合，且形成单个碱基的侵入结构，该结构形成后，所述DNA聚合酶将所述放大探针的单链报告序列连同被侵入的第一个碱基切下，切割下来的序列片段包含单链报告序列连同被侵入的第一个碱基，将该序列片段称为第一报告引物；所述第一报告引物与检测探针完整互补配对，并沿着检测探针的延伸序列部分延伸形成第一双链产物，当只检测到所述第一双链产物形成时，即可判定含有所述靶基因的核酸样品中所述SNP位点为野生型； 4.1.2.若所述靶基因SNP位点为突变型时，此时，所述媒介探针中所述靶基因特异性结合序列的第一个碱基与突变型靶基因不互补结合，此时，所述靶基因特异性结合序列的第一个碱基与所述媒介序列均不与靶基因互补结合，所述第一引物和第二引物均进行延伸扩增，沿5’端至3’端延伸至所述媒介探针中所述靶基因特异性结合序列的第一个碱基时，DNA聚合酶将切割所述靶基因特异性结合序列中与靶基因配对结合的第一个碱基和第二个碱基之间的磷酸二酯键，切割下来的序列片段包含媒介序列、所述靶基因特异性结合序列的第一个碱基以及与靶基因配对结合的第一个碱基，将该片段称为第二媒介引物；第二媒介引物与放大探针特异性结合，且形成两个碱基的侵入结构，该结构形成后，所述DNA聚合酶将放大探针的报告序列连同被侵入的第一个及第二个碱基切下，将该序列片段称为第二报告引物；所述第二报告引物与所述检测探针互补结合时，所述第二报告引物3’端最后一个碱基不能与检测探针互补结合，所述第二报告引物不能沿着检测探针延伸，因此得到第二双链产物，当只检测到所述第二双链产物形成时，即可判定含有所述靶基因的核酸样品中所述SNP位点为突变型； 4.1.3.若所述靶基因SNP位点为杂合型时，此时将同时生成所述第一双链产物和所述第二双链产物，因此，当检测到所述第一双链产物和所述第二双链产物同时形成时，即可判定含有所述靶基因的核酸样品中所述SNP位点为杂合型； 4.2.当所述靶基因特异性结合序列的第一个碱基序列为与所述靶基因SNP位点的错义突变型碱基互补时： 4.2.1.若所述靶基因SNP位点为野生型或同义突变型时，此时，所述媒介探针中所述靶基因特异性结合序列的第一个碱基与所述靶基因不互补结合，此时，所述靶基因特异性结合序列的第一个碱基与所述媒介序列均不与靶基因互补结合，如同上述4.1.2中一样，只检测到所述第二双链产物形成，即可判定含有所述靶基因的核酸样品中所述SNP位点为野生型或同义突变型； 4.2.2.若所述靶基因SNP位点为错义突变型时，此时，所述媒介探针中所述靶基因特异性结合序列的第一个碱基与错义突变型靶基因互补结合形成SNP位点碱基对，如同上述4.1.1中一样，只检测到所述第一双链产物形成，即可判定含有所述靶基因的核酸样品中所述SNP位点为错义突变型； 4.2.3.如同上述4.1.3中一样，当检测到所述第一双链产物和所述第二双链产物同时形成时，即可判定含有所述靶基因的核酸样品中所述SNP位点为杂合型。

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