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龙图腾网获悉珠江水资源保护科学研究所申请的专利一种鱼类种质资源库的建立方法获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN119229949B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-08-05发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202411168113.2，技术领域涉及：G16B5/00；该发明授权一种鱼类种质资源库的建立方法是由朱远生;熊芳园;王丽;刘丽诗;邓森;吝少熊;杜春贵;李淼;林志友;陈钰林;陶荣;万双民;杨晓灵;俄泽琛;王月设计研发完成，并于2024-08-23向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种鱼类种质资源库的建立方法在说明书摘要公布了：本发明涉及一种鱼类种质资源库的建立方法，属于生物种质资源保护技术领域。本发明公开了一种鱼类种质资源库的建立方法，通过调查鱼类种质资源和栖息地、确定目标鱼类、确定鱼类种质资源库子库类型、确定鱼类种质资源库子库的最小样品储存量、样品采集、样品处理、样品储存、样品质量定期检测、建立鱼类种质资源数据库和鱼类种质资源数据管理建立完整的鱼类种质资源库，对鱼类种质资源信息进行保存与共享。本发明能够实现鱼类种质资源的数字化和信息化，对鱼类种质资源的信息数据进行分层级、多维度、全覆盖管理，便于资源的查询、交换和共享，提高了资源利用效率，促进了信息的透明交流和科研合作，为我国种源安全和种业振兴建设提供了技术支撑。

本发明授权一种鱼类种质资源库的建立方法在权利要求书中公布了：1.一种鱼类种质资源库的建立方法，其特征在于，包括以下步骤： （1）调查鱼类种质资源和栖息地：采取实地调查和查阅有关资料相结合的方式，对流域鱼类种质资源和栖息地进行调查，得到鱼类物种多样性、种群结构和时空分布信息；通过历史资料分析以及现场实地踏勘了解鱼类的生活习性和水文特征，得到鱼类的产卵场、索饵场及越冬场的栖息地分布概况； （2）确定目标鱼类：根据水域内鱼类的物种保护等级、代表性和相对重要性指数选择鱼类种质资源库的目标鱼类； （3）确定鱼类种质资源库子库类型：根据每个目标鱼类物种的濒危情况，确定每个目标鱼类物种对应的种质资源库子库的类型； （4）确定鱼类种质资源库子库的最小样品储存量：结合各个子库构建的难易程度，计算每个目标物种的7大子库最小样品储存量； （5）样品采集：对步骤（2）中选择的鱼类样品进行相应的样品采集；通过野外捕捞、水产原、良种场、苗种繁育场和养殖场采集鱼类样品； （6）样品处理：对步骤（5）中采集的样品根据活体库、标本库、组织库、基因库、精子库和细胞库的不同要求进行处理，达到活体库、标本库、组织库、基因库、精子库和细胞库样品保存的要求并获取对应的信息； A.活体库样品处理： a.运输和转移：使用合适的容器和适当的水质条件将采集到的鱼类个体安全地运输到活体库，避免过度拥挤和长时间的运输，以减少运输过程对个体的压力和死亡率； b.暂养：将采集到的鱼类个体暂时安置在适合的暂时保持设施中，确保提供适当的水质条件、饮食和生活空间，以促进个体的适应和健康； c.健康评估和筛选：对每个个体进行健康评估，检查是否存在疾病、损伤或其他健康问题，筛选出健康的个体作为最终入库的样品，避免将患病或不适合入库的个体引入活体库； d.入库前的适应性评估：在个体进入活体库之前，进行适应性评估，确保它们能够适应新的环境条件和社会结构，适应性评估至少包括对个体的行为观察、食物摄取情况和社交互动方面的监测； e.入库和标识：将符合标准的个体正式引入活体库，并进行标识，活体库标识至少包括个体编号、采集信息和健康状况； f.健康监测：定期检查和评估活体库中个体的健康和繁殖状况，根据监测情况，调整饲养和管理策略，以最大化活体库个体的生存和繁殖成功率； B.标本库样品处理： 鱼类标本类型多，主要包括浸制标本、剥制标本、骨骼标本和透明标本，浸制标本是将鱼类整体或部分部位直接放入各种化学药品固定保存的一类标本；剥制标本是指通过各种方法保留鱼皮并将其填充各种材料恢复至原有状态的标本；骨骼标本是指将鱼类整体或部分经过各种方法剔除鱼类内脏和肌肉组织仅保留骨骼，并通过化学药品去脂、漂白并将骨骼整形串联的一类标本；透明骨骼标本是指小型鱼类经过化学药品脱脂、透明和染色后，可被清晰观察其硬骨和软骨组织；将处理完成的标本放入标本库，并进行标识，标本库标识至少包括标本编号、标本类型和标本鱼类种类； C.组织库样品处理： a.采集人员带上一次性橡胶手套后，先用火焰灼烧酒精清洗过的剪刀前段，等其冷却后剪取标本的鳍条或肌肉组织； b.然后用酒精清洗过的镊子将其放入事先准备好的2ml离心管，拧上试管盖放入冻存盒中；离心管内含标签号和95%以上乙醇； c.在取下一份分子组织材料前重复清洗工具，以免交叉污染； D.基因库样品处理： a.样品抽样：对所需构建基因组DNA文库的水产生物按照GBT18654.2的规定执行，确定抽样样品数目； b.基因组DNA的提取：采用传统的基因组DNA提取方法或商品化的基因组DNA提取试剂盒提取物种的基因组DNA； c.基因组DNA的处理：根据选用载体的不同，用合适的限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，以产生能与载体匹配末端； d.检测并回收大小合适的DNA酶切片：对附切所得的DNA片段，进行琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像仪观察，对大小适宜的酶切段用低熔点琼脂糖凝胶回收； e.载体的选择：根据基因组目标区城的大小、筛选文库的难易程度和载体的拷贝数大小因素选择合适的载体； f.基因组DNA片段与载体的连接：使用连接酶把上述大小合适的DNA片段连接入载体； g.重组载体转入宿主细胞及阳性克隆的鉴定：将重组载体转入感受态的宿主细胞，利用菌落的蓝白斑指示筛选阳性克隆； E.精子库样品处理： a.用毛巾或纸巾擦干成熟雄鱼腹部及生殖孔区域水分，轻压腹部排除尿液，用干燥吸管收集排出的精液，置于干净、干燥且带有刻度的玻璃瓶或试管中，操作和运输过程中避免阳光直射； b.利用显微镜检查，观察三次，取平均数，精子成活率在80%以上的精液可用于冷冻保存；精子成活率为运动精子占全部精子的百分数； c.根据鱼类种类的不同，选择适宜的冷冻保存稀释液与抗冻剂，完成采精和镜检后加入冷冻稀释液，将不同鱼类的精液与预冷的稀释液按比例混合后需置于4℃冰箱中平衡20min～30min； d.将平衡好的精液加稀释液以1.0mL~1.5mL分装于2ml冻存管中，按照三步降冷冻模式，投入液氮冷冻保存； e.解冻时，先将冻存管从液氮中提出置于液氮蒸气中平衡2min～3min，然后从液氮罐中拿出，放入37℃水浴中快速解冻或在室温下解冻；冻精解冻后与鲜卵进行干法授精，将适量冷冻精液倒于卵子上，轻轻搅拌混匀，加相当于卵量2倍～3倍的淡水或海水激活精子，静置10min后加入5倍～10倍的水洗去死卵和多余的精子，将受精卵置于解化器中化； F.细胞库样品处理： a.在超净工作台中将采集的鱼类组织块用PBS清洗至少3次； b.将组织移入加有L-15培养基的青霉素小瓶中，用剪刀将组织剪成1mm的小块，再用PBS清洗3次； c.用少量L-15完全培养基浸润后均匀接种于25cm2培养瓶，在培养瓶侧壁记录细胞信息，包括组织类别、时间及培养代数，倒置于合适温度培养箱培养； d.10-12h后加入3ml完全培养基并开始正置培养，原代培养期间每2~3天换一次培养基； e.继代培养需待细胞贴壁生长至盖底部95%时进行第一次传代，第一次进行原瓶传代，以后传代按1传2比例传代，进行继代培养；将原来的培养基吸出，PBS清洗后加入适量胰消化，待细胞收缩变圆，即将脱壁时吸出胰酶，加入培养基数次吹打至细胞脱壁； （7）样品储存：活体库样品储存方法为修建养殖鱼池进行易地保护；标本库样品储存方法为将标本或器官放入10%福尔马林溶液中，多次置换溶液直至固定，然后放入5%福尔马林溶液再固定2-3周，最后放入有保存液的玻璃标本瓶中，用凡士林或石蜡密封，防止固定液挥发或泄露；组织库样品储存方法为将采集到的组织样品放于含有95%以上乙醇的2ml离心管内，在-20℃或-70℃保存环境下保存；基因库样品储存方法为将经测定符合要求的基因组DNA溶于pH值8.0的TE中保存；精子库样品储存方法为将平衡好的精液加稀释液以1.0mL～1.5mL分装于2mL冻存管中，按照三步降温冷冻模式，投入液氮冷冻保存；细胞库样品储存方法为将培养基吸出，用磷酸缓冲液冲洗细胞后，加适量胰酶消化，待贴壁生长的细胞呈细小圆形将要脱壁时，吸出胰酶，加入适量培养基吹打，使细胞脱壁；将吹打后的细胞悬液与细胞冷冻保存用培养基等体积混合，装入冻存管中，先在4℃冰箱中置30min，然后在-80℃冰箱中置2h~4h，最后将细胞冻存管保存于液氮中； （8）样品质量定期检测：样品入库后，每批次随机抽取三个样品进行检测，定期评估鉴定样品质量，剔除达不到要求的样品，重新补充； 活体库：定期检测鱼类活体健康状况、成活率和生长率，若鱼类出现疾病，则剔除该批次样品，重新补充； 标本库：定期从标本缸中将标本样品取出，观察标本形态变化，若形态变化大，标本腐烂严重，则剔除该批次样品，重新补充； 组织库：定期观察冰箱中的组织样品是否密封，是否放于-20℃或-70℃保存，是否多次冻融；多次冻融会导致所得基因组DNA的片段变小且提取质量下降；若未密闭、温度不达标或冻融次数高于5次，则剔除该批次样品，重新补充； 基因库：定期从冰箱中将DNA样品取出进行浓度、纯度和完整性检测； DNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有强的吸收，其吸收峰在260nm处；通过检测DNA样品260nm和280nm处波长吸光值： A260A280的比值为1.8-2.0，说明纯度良好；A260A2801.8，说明在核酸提取中有蛋白杂质残留或者样品浓度非常小；260A2802.0，说明DNA有部分降解或有RNA污染； 较纯净的核酸A260A230的比值应大于2.0，根据纯度检测计算出DNA浓度，一般DNA样品浓度在100-300nguL有利于DNA长期保存； 通过凝胶电泳分析DNA的完整度，加样孔附近有一条明亮条带，无杂质及拖尾现象，表明DNA分子完整，无降解；如果加样孔有亮带，说明DNA溶液中有蛋白质残留；若泳道有弥散和拖尾现象，说明DNA存在降解； 若DNA样品浓度低于100nguL，则剔除，重新补充；若DNA样品中A260A2802.0，则剔除，重新补充；若DNA样品完整性差，泳道有弥散、拖尾现象，则剔除，重新补充； 精子库：定期从液氮罐中将精子样品取出解冻复苏，检测冷冻复苏后精子的活力，若复苏率均低于50%，则剔除该批次样品，重新补充； 细胞库：定期从液氮罐中将细胞样品取出解冻复苏，复苏方法为每代细胞随机抽取三个样品进行复苏培养，待细胞重新分裂后，通过显微镜观察该传代细胞的细胞畸形程度，若均出现畸形，则剔除该代细胞所有样品，重新补充； （9）建立鱼类种质资源数据库：根据步骤（1）至（7）中得到的各种数据，建立完整的鱼类种质资源数据库，鱼类种质资源数据库以鱼类种质资源空间分布数据、鱼类栖息地空间分布数据和目标鱼类种质资源库数据为一级类进行构建，具体构建方法如下： S1、收集鱼类种质资源和栖息地基础数据：设定待构建的鱼类种质资源数据库所要研究的地理区域范围，通过实际调查的方式获取该地理区域范围内的鱼类种质资源和栖息地基础数据； S2、建立鱼类种质资源空间分布数据：对鱼类种质资源数据进行预处理，以空间数据为主体形成基础数据库，并分离获得鱼类种质资源空间分布数据； 鱼类种质资源空间分布数据按其一级类鱼类种质资源空间分布数据类型提取并细化到二级类和三级类数据类型形成，该二级类数据类型包括研究区域内的所有物种，三级类按生物数据类型分为丰度和生物量数据；基于基础数据库设定的鱼类种质资源空间分布数据的数据结构包括政区名称、政区代码、鱼类种质资源类型及编码、鱼类种质资源二级类型及编码、鱼类种质资源空间分布数据三级类型及编码和单位捕捞努力量渔获尾数； S3、建立栖息地空间分布数据：对鱼类栖息地数据进行预处理，以空间数据为主体形成基础数据库，并分离获得鱼类栖息地空间分布数据； 鱼类栖息地空间分布数据按其一级类鱼类栖息地空间分布数据类型提取并细化到二级类和三级类数据类型形成，该二级类数据类型包括研究区域内的所有物种，三级类按栖息地数据类型分为产卵场、索饵场和越冬场数据；基于基础数据库设定的鱼类栖息地空间分布数据的数据结构包括政区名称、政区代码、鱼类栖息地空间分布数据及编码、鱼类栖息地空间分布数据二级类型及编码、鱼类栖息地空间分布数据三级类型及编码和图斑面积； S4、建立目标鱼类种质资源库数据：对目标鱼类种质资源库数据进行处理和分析，获得鱼类栖息地空间分布数据； 鱼类栖息地空间分布数据按其一级类目标鱼类种质资源库数据数据类型提取并细化到二级类和三级类数据类型形成，该二级类数据类型包括活体库、标本库、组织库、基因库、精子库和细胞库，三级类数据类型分为样品标记信息、样品处理信息和样品遗传信息； （10）鱼类种质资源数据管理：根据步骤（9）中的数据库，建立鱼类种质资源数据管理系统，包括容器管理系统、样品管理系统、数据管理系统和安全管理系统；容器管理系统用于对储存样品的设备数据进行管理；样品管理系统至少包括管理不同类型样品的增减和状态，通过鱼类无线射频识别芯片技术，自动化样品信息录入及维护流程，记录样品的使用和维护历史，实时监控资源库的状态，记录增减变化，同时提供查询各类资源库信息的接口；数据管理系统实现基因和信息数据的处理、存储逻辑，设计数据的分发和访问接口，确保数据的安全性和完整性；实现数据的结构化和持久化存储，设计开发在线资源共享平台的逻辑功能；安全管理系统通过对信息系统的架构、承载的业务和系统定级的综合分析确定系统的安全风险和防护需求，依据相应的保护要求，平衡安全、成本和效率之间的关系，确定安全保护措施。

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