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龙图腾网获悉复旦大学附属妇产科医院申请的专利一种细胞外囊泡途径优化精子功能的制剂、制备方法及在精子损伤修复系统上的应用获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN119753014B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-08-15发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202411762481.X，技术领域涉及：C12N15/85；该发明授权一种细胞外囊泡途径优化精子功能的制剂、制备方法及在精子损伤修复系统上的应用是由张晨;任静朝;刘婷婷;孙宽;林仙华;黄荷凤设计研发完成，并于2024-12-03向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种细胞外囊泡途径优化精子功能的制剂、制备方法及在精子损伤修复系统上的应用在说明书摘要公布了：本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种细胞外囊泡途径优化精子功能的制剂、制备方法及在精子损伤修复系统上的应用。所述方法包括以下步骤：步骤一、构建质粒；步骤二、细胞转染和构建细胞系；步骤三、分离外泌体。所述步骤一中构建质粒，包括先从cDNA的PCR反应扩增SKAP2‑CDS序列；再将SKAP2‑CDS序列插入到BamHI和EcoRI位点之间的PHY‑GFP质粒中，得到重组质粒。本发明中，借鉴精浆胞外囊泡蛋白对精子功能影响，采用外泌体改造技术，将精浆胞外囊泡中关键蛋白SKAP2表达到工程外泌体中，在体外精子添加培养可以有效提高精子运动、获能和顶体反应，改善精子功能。

本发明授权一种细胞外囊泡途径优化精子功能的制剂、制备方法及在精子损伤修复系统上的应用在权利要求书中公布了：1.一种细胞外囊泡途径优化精子功能的制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤一、构建质粒； 从cDNA的PCR反应扩增SKAP2-CDS序列； 将SKAP2-CDS序列插入到BamHI和EcoRI位点之间的PHY-GFP质粒中，得到重组质粒； 其中，所述cDNA包括人cDNA和小鼠cDNA； 从人cDNA的PCR反应扩增得到的是人SKAP2-CDS序列，从小鼠cDNA的PCR反应扩增得到的是小鼠SKAP2-CDS序列； 人SKAP2-CDS的正向引物的序列如SEQIDNO.1所示： 5’-TGATAAGGCCATTGCCGTGGATCCAATGCCCAACCCCAGCAGCACCTCCT-3’； 人SKAP2-CDS的反向引物的序列如SEQIDNO.2所示： 5’-CGCCGCTGCCGCCACCGCCGAATTCAATATCATACATCTCCATTATGTAG-3’； 人SKAP2的序列如SEQIDNO.3所示： ATGCCCAACCCCAGCAGCACCTCCTCTCCCTACCCCCTCCCTGAGGAAATTAGGAACCTGTTGGCAGATGTTGAAACATTTGTAGCAGATATACTGAAAGGAGAAAATTTATCCAAGAAAGCAAAGGAAAAGAGAGAATCCCTTATTAAGAAGATAAAAGATGTAAAGTCTATCTATCTTCAGGAATTTCAAGACAAAGGTGATGCAGAAGATGGGGAAGAATATGATGACCCTTTTGCTGGGCCTCCAGACACTATTTCATTAGCCTCAGAACGATATGATAAAGACGATGAAGCCCCCTCTGATGGAGCCCAGTTTCCTCCAATTGCAGCACAAGACCTTCCTTTTGTTCTAAAGGCTGGCTACCTTGAAAAACGCAGAAAAGATCACAGCTTTCTGGGATTTGAATGGCAGAAACGGTGGTGTGCTCTCAGTAAAACGGTATTCTATTATTATGGAAGTGATAAAGACAAACAACAGAAAGGTGAATTTGCAATAGATGGCTACAGTGTCAGAATGAATAACACTCTAAGAAAGGATGGAAAGAAAGATTGCTGTTTTGAAATCTCTGCTCCTGATAAACGTATATATCAGTTTACAGCAGCTTCTCCCAAAGATGCTGAAGAATGGGTACAGCAGCTGAAATTTGTATTGCAAGATATGGAATCTGATATTATTCCTGAGGATTATGATGAGAGAGGAGAATTATATGATGATGTTGATCATCCTCTACCAATAAGCAATCCACTAACAAGCAGTCAACCAATAGATGATGAAATTTATGAAGAACTTCCAGAAGAAGAAGAGGACAGTGCTCCAGTGAAAGTGGAAGAACAAAGGAAGATGAGTCAGGATAGTGTCCATCACACCTCAGGGGATAAGAGCACTGATTATGCTAATTTTTACCAGGGATTGTGGGATTGTACTGGAGCTTTTTCTGATGAGTTGTCATTTAAGCGTGGTGATGTGATTTACATTCTTAGCAAGGAATACAATAGATATGGCTGGTGGGTAGGAGAAATGAAGGGAGCCATTGGCTTGGTGCCTAAAGCCTACATAATGGAGATGTATGATATTTGA； 小鼠SKAP2-CDS正向引物的序列如SEQIDNO.4所示： 5’-TGATAAGGCCATTGCCGTGGATCCAATGCCCAACCCCAGCTGTACCTCTT-3’； 小鼠SKAP2-CDS反向引物的序列如SEQIDNO.5所示： 5’-CGCCGCTGCCGCCACCGCCGAATTCAATATCATACATCTCCATTAGGTAG-3’； 小鼠SKAP2的序列如SEQIDNO.6所示： ATGCCCAACCCCAGCTGTACCTCTTCTCCCGGCCCTCTCCCTGAGGAAATTAGGAACCTGTTGGCAGATGTTGAAACATTTGTGGCAGACACACTGAAAGGAGAAAATTTATCCAAGAAAGCCAAGGAAAAGAGAGAATCTCTCATTAAGAAGATAAAAGATGTAAAGTCTGTCTATCTTCAGGAATTTCAAGACAAAGGTGATGCTGAGGACGGCGATGAATATGACGATCCCTTTGCTGGGCCTGCAGACACGATTTCCTTAGCCTCAGAGCGCTACGATAAAGATGATGATGGCCCCTCTGATGGAAACCAGTTTCCTCCCATTGCAGCCCAGGACCTTCCTTTTGTCATAAAGGCTGGCTACCTGGAAAAACGCAGAAAAGATCACAGCTTTCTGGGGTTTGAATGGCAGAAACGGTGGTGTGCGCTCAGCAAAACAGTGTTCTATTATTACGGGAGCGATAAAGACAAGCAACAGAAAGGTGAATTTGCAATAGATGGCTATGATGTCAGAATGAACAACACCCTTAGGAAGGATGGAAAGAAAGATTGCTGTTTTGAAATCTGTGCTCCCGACAAACGTATCTATCAGTTTACAGCAGCCTCTCCCAAAGATGCTGAGGAATGGGTCCAGCAGCTGAAATTTATACTACAAGACCTGGGATCCGACGTTATTCCTGAGGATGATGAGGAAAGAGGAGAATTATATGATGACGTTGACCATCCTGCTGCCGTCAGCAGCCCGCAGAGGAGCCAGCCAATCGATGATGAGATTTATGAGGAGCTCCCAGAGGAGGAAGAGGACACTGCTTCAGTGAAGATGGACGAGCAAGGGAAGGGAAGTCGGGACAGTGTGCATCACACCTCAGGAGATAAAAGCACTGATTACGCTAATTTTTACCAGGGTCTGTGGGACTGCACTGGAGCTCTGTCTGATGAGTTGTCCTTTAAGCGTGGTGATGTGATTTACATTCTTAGCAAGGAATACAATAGATATGGCTGGTGGGTAGGAGAGATGAAGGGAGCCATTGGCTTGGTGCCTAAAGCCTACCTAATGGAGATGTATGATATTTGA； 所述PCR反应体系包括：2×PhantaMaxMasterMix、上游引物、下游引物、cDNA模板、DNA聚合酶、去离子水，PCR反应程序包括：预变形、变性、退火、延伸、循环、完全延伸； 所述将SKAP2-CDS序列插入到BamHI和EcoRI位点之间的PHY-GFP质粒的过程包括：采用BamHI和EcoRI内切酶分别对SKAP2的PCR产物和PHY-GFP质粒进行双酶切，使用DNA连接酶将酶切后的目的基因片段与质粒片段连接起来，形成重组质粒； 步骤二、细胞转染和构建细胞系； 先使用EZ反式转染试剂进行重组质粒转染，再使用重组质粒产物对HEK293T细胞进行转染，纯化，收集上清液； 所述细胞转染的过程具体包括： （1）使用EZ反式转染试剂进行重组质粒转染：将EZTrans转染试剂稀释到无血清的高糖DMEM培养基中，混匀，得到稀释好的转染试剂；将重组质粒DNA稀释到无血清的高糖DMEM培养基中，混匀，加入稀释好的转染试剂，混匀，室温放置，完成重组质粒转染，形成EZTrans-DNA复合物，即重组质粒产物； （2）将EZTrans-DNA复合物滴入到含HEK293T细胞的培养皿中，分散均匀，共孵育对细胞进行转染； 使用收集到的上清液和新鲜培养基培养HEK293T细胞，培养完成后，将HEK293T细胞转移至在含有嘌呤霉素的培养基中继续培养，继续培养后，将HEK293T细胞转移至在含有嘌呤霉素的培养基中进行后续培养，得到细胞系； 步骤三、分离外泌体； 将细胞系扩增培养，扩增培养完成后，洗涤，培养，收集上清液；对上清液进行离心处理，过滤，浓缩，向浓缩液中加入PBS，再次浓缩，得到外泌体悬浮液； 所述外泌体悬浮液即为细胞外囊泡途径优化精子功能的制剂。

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