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龙图腾网获悉上海欧易生物医学科技有限公司申请的专利一种在同一肝内胆管组织样本中同时进行外泌体、单细胞、单细胞核测序的方法获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN115992086B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-08-15发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202211484254.6，技术领域涉及：C12N5/071；该发明授权一种在同一肝内胆管组织样本中同时进行外泌体、单细胞、单细胞核测序的方法是由佟思雨;殷昊;肖云平;范黎明;朱燕敏;王佳琦设计研发完成，并于2022-11-24向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种在同一肝内胆管组织样本中同时进行外泌体、单细胞、单细胞核测序的方法在说明书摘要公布了：本发明公开了一种从同一肝内胆管组织样本出发，基于同一组织样本同时进行外泌体、单细胞悬液和单细胞核悬液的制备方法。本发明所述的方法可以在同一份样本中得到更多有意义的数据，挖掘到更深层次的生物学信息，从而解析出生物现象背后这个网络最关键的一个动态机制。本发明创新改进地将外泌体制备、单细胞悬液制备和单细胞核悬液制备三种技术相结合，突破了现有的技术障碍，得到样本中更全面的细胞类型的同时，又真正解析了生命现象背后这种细胞互作的网络机制既能了解单个细胞的功能，又能了解细胞之间是如何传递信号的以及特定的细胞对信号会有什么响应。从而丰富了研究数据，为挖掘更深层次的生物学机理提供了基础。

本发明授权一种在同一肝内胆管组织样本中同时进行外泌体、单细胞、单细胞核测序的方法在权利要求书中公布了：1.在同一肝内胆管组织样本中同时制备外泌体、单细胞悬液和单细胞核悬液的方法，其特征在于，包括如下步骤： 一样本准备： 取人肝内胆管组织，清洗，剪碎，并将剪碎的组织块转移至离心管中； 二酶解： 加入培养基，加入终浓度为0.5％的胶原酶Ⅱvv溶液、0.3％的胶原酶Ⅳ溶液、0.1％的透明质酸酶vv溶液进行37℃消化酶解15min，37℃酶解结束后加入0.2％vv的胰酶溶液，混匀后室温静置； 三分离： 室温静置后得到第一上清液、第一沉降的组织沉淀，收集的第一上清液进行第一次离心分离再次得到第二上清液、第二细胞沉淀，所述的第一次离心条件为2000～3000×g、5～10min、4～6℃； 四外泌体制备： 取前述步骤三中第二上清液再次进行第二次离心处理，所述的第二次离心条件为13000×g～16000×g、5～10min、4～6℃，得到第三上清液与第三细胞沉淀；离心结束后，取上述第三上清液进行过筛处理，结束后采用Invitrogen-TotalExosomeIsolationReagentfromcellculturemedia试剂盒对滤液进行外泌体纯化； 五悬液制备： 单细胞悬液的制备： 取前述步骤三中第二细胞沉淀与步骤四中第三细胞沉淀分别使用培养基重悬后，转移到同一离心管中，进行过筛处理；过筛处理结束后进行第一次离心处理，所述第一次离心条件为500～800×g、5～10min、4～6℃，离心结束后弃上清，向细胞沉淀中加入红细胞裂解液，吹打混匀后室温静置，裂红结束后进行第二次离心处理，第二次离心条件为500～800×g、5～10min、4～6℃，离心结束后弃上清，加入磁珠去死细胞试剂对细胞沉淀进行重悬，并孵育15min后，用1×buildingbuffer润洗LS柱，将细胞混合液过柱后，第三次离心处理，所述第三次离心条件为300～500×g、5～10min、4～6℃，离心结束后弃上清，加入预冷的培养基对细胞沉淀进行第四次离心洗涤处理，所述第四次离心条件为100～500×g，离心5～10min，离心结束后弃上清，加入预冷培养基对细胞沉淀进行重悬处理，得到单细胞悬液； 单细胞核悬液的制备： 取前述步骤三中第一沉降的组织沉淀，使用PBS进行洗涤处理、第一次离心洗涤弃上清后，所述第一次离心条件为500g～1000×g，离心5～10min，再次加入PBS洗涤，洗涤结束后加入裂解缓冲液重悬组织沉淀开始裂解处理，所述的裂解缓冲液包括以下成份，终浓度为：50mMTris-HClpH＝7.5、1mMCaCl2、5mMNaCl、0.3％～0.4％vvNP40、0.3％～0.4％vv吐温20、0.4UμLRNaseInhibitor，整个过程置于冰上孵育，裂解结束后进行过筛处理，过筛后收集滤液，第二次离心处理后弃上清，所述第二次离心的条件为800～1000×g、4～6℃离心5～15分钟，加入细胞核洗涤缓冲液重悬细胞核沉淀，所述细胞核洗涤缓冲液包含以下成分，终浓度为：50mMTris-HClpH＝7.5、1mMCaCl2、5mMNaCl、0.4UμLRNaseInhibitor、1％～2％vvBSA，第三次离心洗涤后弃上清，所述第三次离心条件为500～1000×g、4℃离心5～10分钟，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到单细胞核悬液。

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