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龙图腾网获悉南京医科大学申请的专利一种类原肠胚干细胞系的构建方法及应用获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN117757726B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-08-15发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202211135955.9，技术领域涉及：C12N5/0735；该发明授权一种类原肠胚干细胞系的构建方法及应用是由沙家豪;袁艳;黄铭茜;陈梦琦;张浩;员格格设计研发完成，并于2022-09-19向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种类原肠胚干细胞系的构建方法及应用在说明书摘要公布了：本发明一种类原肠胚干细胞系的构建方法及应用，本研究建立了可以稳定传代的类原肠胚干细胞，该细胞在一定程度上保留了干细胞的潜能性，且出现原肠胚发育阶段内，中，外三个胚层细胞的基因和蛋白的表达，其特征与原肠胚阶段细胞的特征一致，能够较好的复现原肠胚阶段的细胞关键特征。采用该干细胞系能够在小鼠体内或在体外构建出能够模拟原肠胚发育的三维类原肠胚体模型，并能部分复现体内胚胎发育过程中内外胚层谱系的分离、前羊膜腔的形成、原条出现以及中胚层谱系特化等关键生物学事件，能够较好的复现植入后原肠胚期胚胎的关键特征。应用本模型能够在体外建立影响早期胚胎发育的药物筛选平台，为临床用药提供参考。

本发明授权一种类原肠胚干细胞系的构建方法及应用在权利要求书中公布了：1.一种类原肠胚干细胞系的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤： （1）干细胞向中胚层方向诱导： （1-1）将干细胞消化为单细胞，将细胞进行重悬，得到细胞悬液1； 所述干细胞为人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞； 所述人胚胎干细胞为已建立的人胚胎干细胞，来源于未经过体内发育的受精14天以内的胚胎； （1-2）取细胞悬液1离心后弃去上清液，加入含有ROCK抑制剂的GK15-1培养液进一步重悬细胞，得到细胞悬液2； （1-2）中所述含有ROCK抑制剂的GK15-1培养液的成分包含： 体积百分比为80~85%的基础培养基GMEM，体积百分比为10~15%的血清替代物KOSR、体积百分比为1%的青霉素-链霉素双抗、体积百分比为1%的10 mM非必需氨基酸、体积百分比为1%的200 mMGlutaMAX添加剂、体积百分比为1%的100mM丙酮酸钠添加剂、0.1mMβ-巯基乙醇，以及25-200ngmL重组人激活素A因子、1-10μM糖原合酶激酶-3GSK-3抑制剂CHIR99021、5-20μMROCK抑制剂； （1-3）将（1-2）得到的细胞悬液2接种到提前使用基质胶进行包被的孔板中，培养； （1-4）培养第二天，去除陈旧培养基，更换为GK15-1培养液，每天换液，直至获得类新生中胚层细胞； （1-4）中所述GK15-1培养液的成分包含： 体积百分比为80~85%的基础培养基GMEM，体积百分比为10~15%的血清替代物KOSR、体积百分比为1%的青霉素-链霉素双抗、体积百分比为1%的10 mM非必需氨基酸、体积百分比为1%的200 mMGlutaMAX添加剂、体积百分比为1%的100mM丙酮酸钠添加剂、0.1mMβ-巯基乙醇，以及25-200ngmL重组人激活素A因子、1-10μM糖原合酶激酶-3GSK-3抑制剂CHIR99021； （2）类新生中胚层细胞向类原始生殖细胞方向诱导： （2-1）在（1-4）得到的类新生中胚层细胞长至60-90%汇合度时将细胞消化为单细胞，将细胞进行重悬，得到细胞悬液3； （2-2）中所述含有ROCK抑制剂的GK15-2培养液的成分包含： 体积百分比为80~85%的基础培养基GMEM，体积百分比为10~15%的血清替代物KOSR、体积百分比为1%的的青霉素-链霉素双抗、体积百分比为1%的10 mM非必需氨基酸、体积百分比为1%的200 mMGlutaMAX添加剂、体积百分比为1%的100mM丙酮酸钠添加剂、0.1mMβ-巯基乙醇、100-500ngmL重组人骨形态发生蛋白4、50-200ngmL重组人干细胞因子、1000-5000UmL重组人白血病抑制因子、50-250ngmL重组人表皮生长因子、5-20μMROCK抑制剂； （2-2）取细胞悬液3离心弃上清后，加入含有ROCK抑制剂的GK15-2培养液进一步重悬细胞，得到细胞悬液4； （2-3）将（2-2）得到的细胞悬液4接种到低粘性孔板中聚球培养；培养第二天开始，去除陈旧培养基，更换为GK15-2培养液，每天换液，直至培养获得含有类原始生殖细胞的细胞球； （3）细胞纯化： （3-1）将（2-3）得到的细胞球消化为单细胞，使用GK15-2培养液重悬细胞，得到细胞悬液5； （2-3）和（3-1）中所述GK15-2培养液的成分包含： 体积百分比为80~85%的基础培养基GMEM，体积百分比为10~15%的血清替代物KOSR、体积百分比为1%的青霉素-链霉素双抗、体积百分比为1%的10 mM非必需氨基酸、体积百分比为1%的200 mMGlutaMAX添加剂、体积百分比为1%的100mM丙酮酸钠添加剂、0.1mMβ-巯基乙醇、100-500ngmL重组人骨形态发生蛋白4、50-200ngmL重组人干细胞因子、1000-5000UmL重组人白血病抑制因子、50-250ngmL重组人表皮生长因子； （3-2）分选（3-1）得到的细胞悬液5中CD326和CD49f双阳性细胞；加入含有ROCK抑制剂的GK10培养液重悬细胞，得到的细胞悬液6； （3-2）中所述含有ROCK抑制剂的GK10培养液的成分包含：体积百分比为80-85%的基础培养基GMEM，体积百分比为10%的血清替代物KOSR、体积百分比为2.5%的胎牛血清FBS、体积百分比为1%的青霉素-链霉素双抗、体积百分比为1%的10 mM非必需氨基酸、体积百分比为1%的200 mMGlutaMAX添加剂、体积百分比为1%的100mM丙酮酸钠添加剂、0.1mMβ-巯基乙醇、10μM毛喉素、10μM咯利普兰、50-200ngmL重组人干细胞因子、5-20μMROCK抑制剂； （4）细胞扩增： 将（3-2）得到的细胞悬液6接种到提前铺制了丝裂霉素C处理的MEFs作为饲养层细胞的孔板中；培养，24小时后换新鲜GK10培养液，获得所述类原肠胚干细胞系； （4）中所述GK10培养液的成分包含： 体积百分比为80-85%的基础培养基GMEM，体积百分比为10%的血清替代物KOSR、体积百分比为2.5%的胎牛血清FBS、体积百分比为1%的青霉素-链霉素双抗、体积百分比为1%的10mM非必需氨基酸、体积百分比为1%的200 mMGlutaMAX添加剂、体积百分比为1%的100mM丙酮酸钠添加剂、0.1mMβ-巯基乙醇、10μM毛喉素、10μM咯利普兰、50-200ngmL重组人干细胞因子。

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