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龙图腾网获悉涌源合生科技(深圳)有限公司申请的专利一种环形双链DNA的扩增方法获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN118547031B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-08-19发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202411000714.2，技术领域涉及：C12P19/34；该发明授权一种环形双链DNA的扩增方法是由罗可;陈萧宇设计研发完成，并于2024-07-25向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种环形双链DNA的扩增方法在说明书摘要公布了：本申请提供了一种环形双链DNA的扩增方法。包括：采用正向引物和反向引物对环形模板DNA进行聚合酶链式反应扩增，得到线性扩增DNA；其中，正向引物能够结合到环形模板DNA的正链的起始位点；反向引物能够结合到环形模板DNA的负链的起始位点；采用DNA内切酶对线性扩增DNA进行切割，得到线性片段DNA；其中，线性片段DNA的长度与环形模板DNA的长度相同；采用DNA连接酶将线性片段DNA的两端进行连接，得到环形双链DNA。本申请不依赖于活细胞，而是利用体外系统直接对质粒进行扩增，具有扩增速度较快、污染风险较低、无需抗生素选择、可容纳大型质粒和生物安全性较高等优点。

本发明授权一种环形双链DNA的扩增方法在权利要求书中公布了：1.一种环形双链DNA的扩增方法，其特征在于，包括： （1）将GGA组装产物作为环形模板DNA，所述GGA组装产物为基于IIs型限制性内切酶的DNA拼接技术的组装产物，采用正向引物和反向引物对所述环形模板DNA进行PCR扩增，得到长度为所述环形模板DNA两倍以上的线性扩增DNA；其中，所述正向引物能够结合到所述环形模板DNA的正链的起始位点；所述反向引物能够结合到所述环形模板DNA的负链的起始位点；PCR扩增中的DNA聚合酶为Phi29聚合酶，反应条件为：30℃恒温孵育4h； 所述正向引物和所述反向引物为特异性引物时，所述正向引物的序列如SEQIDNO.1所示，为CTGCAGCGGCCGCTACTAGTA，所述反向引物的序列如SEQIDNO.2所示，为GAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG，所述正向引物和所述反向引物为非特异性引物时，所述正向引物和所述反向引物为随机六聚体引物，其序列为5'-NpNpNpNpsNpsN-3'，其中，N表示任意核苷酸，p表示普通磷酸键，s表示硫代磷酸键； （2）将所述线性扩增DNA与DNA内切酶混合，并加入内切酶的反应缓冲液，确保反应环境的pH和离子强度适合所述DNA内切酶的活性；在适当温度下孵育混合物，通过所述DNA内切酶识别并切割所述线性扩增DNA，得到与所述环形模板DNA的长度相同的线性片段DNA；其中，所述DNA内切酶为BbsI内切酶，1μLBbsI内切酶切割1μg底物，反应缓冲液为终浓度1×的rCutsmart缓冲液，于37℃孵育1h； （3）将切割后的所述线性片段DNA与DNA连接酶混合，并加入反应缓冲液；在适当温度下孵育混合物，通过所述DNA连接酶催化所述线性片段DNA两端之间形成磷酸二酯键，得到环形双链DNA；其中，所述DNA连接酶为T4连接酶，向酶切体系中加入1μLT4连接酶，反应缓冲液为终浓度1×的T4连接酶缓冲液，于25℃孵育0.5h或16℃过夜反应，65℃下加热灭活10min，连接产物可直接进行转化； （4）通过琼脂糖凝胶电泳将所述环形双链DNA与其他杂质分开，使用紫外光灯观察并切割出目标DNA条带，并通过冻融法或凝胶提取试剂盒回收纯化后的环形双链DNA。

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