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龙图腾网获悉三亚中国农业科学院国家南繁研究院;中国农业科学院作物科学研究所申请的专利一种二倍体野生稻遗传转化和多基因编辑的方法与体系获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN119685348B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-08-22发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202510193025.6，技术领域涉及：C12N15/29；该发明授权一种二倍体野生稻遗传转化和多基因编辑的方法与体系是由李晶莹;马向杰;夏兰琴;钱前;陈继林设计研发完成，并于2025-02-21向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种二倍体野生稻遗传转化和多基因编辑的方法与体系在说明书摘要公布了：本发明涉及生物技术领域，具体提供一种二倍体野生稻遗传转化和多基因编辑的方法与体系。本发明通过诱导培养基、农杆菌侵染和再生培养基条件优化，建立野生稻遗传转化平台；在此基础上，以驯化关键基因，如控制野生稻株型由匍匐生长到直立生长转变的锌指转录因子编码基因PROG1、决定分蘖角大小的基因D2、控制野生稻芒长与产量的转录因子编码基因An‑1、控制水稻产量的关键多效基因DEP1、控制粒宽的编码基因GW2、控制野生稻颍壳颜色的基因Bh4为靶基因，构建CRISPRCas9介导的二倍体野生稻多基因编辑体系，通过遗传转化获得基因编辑稳定植株，建立一年生和多年生二倍体野生稻基因组编辑技术体系，进而快速获得具有育种利用价值的二倍体野生稻抗逆新型基因资源和新种质。

本发明授权一种二倍体野生稻遗传转化和多基因编辑的方法与体系在权利要求书中公布了：1.一种二倍体野生稻遗传转化和多基因编辑的方法，其特征在于，包括以下步骤： （1）选择转化受体材料，所述转化受体材料为尼瓦拉野生稻O.Nivara； （2）野生稻愈伤的诱导与继代； （3）农杆菌介导的基因编辑转化载体的遗传转化； （4）再生幼苗培养； （5）再生植株驯化移栽后，筛选获得编辑再生植株； 所述基因编辑转化载体是以基因PROG1基因、D2基因、DEP1基因、An-1基因、GW2基因、Bh4基因为靶基因，构建的六基因组合敲除载体pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-tRNA-sgRNA1PROG1-tRNA-sgRNA2An-1-tRNA-sgRNA3DEP1-tRNA-sgRNA4D2-tRNA-sgRNA5GW2-tRNA-sgRNA6Bh4-tRNA-PolyA-Nos；所述六基因组合敲除载体核苷酸序列由SEQIDNO.1和SEQIDNO.2拼接组成；所述PROG1基因、D2基因、DEP1基因、An-1基因、GW2基因、Bh4基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3-8所示； 所述二倍体野生稻植株为尼瓦拉野生稻O.Nivara； 构建所述基因编辑转化载体的步骤如下： S1利用重叠PCR方法获得gRNA-tRNA基础片段：第一轮PCR，利用引物gRNAF1、gRNAR1、gRNAR2获得gRNA基础片段，利用引物tRNAF1、tRNAR1、tRNAR2获得tRNA基础片段；第二轮PCR，以第一轮PCR产物gRNA片段和tRNA片段按照摩尔比1:1进行混合后作为模板，利用引物对gRNAF2tRNAR3进行扩增，最终获得gRNA-tRNA基础片段；所述引物gRNAF1、gRNAR1、gRNAR2的碱基序列如SEQIDNO.9-11所示；所述引物tRNAF1、tRNAR1、tRNAR2的碱基序列如SEQIDNO.12-14所示； S2利用重叠PCR方法获得tRNA-sgRNA1PROG1-tRNA-sgRNA2An-1-tRNA片段：第一轮PCR以gRNA-tRNA基础片段为模板，利用引物对Actin-tRNAF1、PROG1-tRNAR1，获得带PROG1基因靶点序列的tRNA片段，再以gRNA-tRNA基础片段为模板，分别利用引物对PROG1-gRNAF1、An1-tRNAR1和An1-gRNAF1、PolyA-tRNA-R1进行扩增，分别获得带接头的sgRNA1PROG1-tRNA和sgRNA2An-1-tRNA片段；第二轮PCR以第一轮获得的上述3个PCR产物按照摩尔比1:1:1进行混合后作为模板，利用引物对ActinF1、PolyA-R1进行扩增，最终获得tRNA-sgRNA1PROG1-tRNA-sgRNA2An-1-tRNA片段，并进行纯化回收；与此同时，利用限制性内切酶PmeI对载体pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-PolyA-Nos进行酶切，并回收酶切产物；最后利用同源重组酶将回收产物进行连接获得PROG1+An-1双基因组合敲除载体pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-tRNA-sgRNA1PROG1-tRNA-sgRNA2An-1-tRNA-PolyA-Nos；所述Actin-tRNAF1的碱基序列如SEQIDNO.15所示；所述PROG1-tRNAR1的碱基序列如SEQIDNO.16所示；所述PROG1-gRNAF1的碱基序列如SEQIDNO.17所示；所述An1-tRNAR1的碱基序列如SEQIDNO.18所示；所述An1-gRNAF1的碱基序列如SEQIDNO.19所示；所述PolyA-tRNA-R1的碱基序列如SEQIDNO.20所示；所述ActinF1的碱基序列如SEQIDNO.21所示；所述PolyA-R1的碱基序列如SEQIDNO.22所示； S3利用引物对DEP1-gRNAF1、D2-tRNAR1和D2-gRNAF1、PolyA-tRNA-R1和DEP1-gRNAF2、PolyA-R1通过重叠PCR方法获得tRNA-sgRNA3DEP1-tRNA-sgRNA4D2-tRNA片段；与此同时，利用限制性内切酶PmeI对载体pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-tRNA-sgRNA1PROG1-tRNA-sgRNA2An-1-tRNA-PolyA-Nos进行酶切，并回收酶切产物；最后利用同源重组酶将上述回收产物进行连接获得PROG1+An-1+DEP1+D2四基因组合敲除载体pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-tRNA-sgRNA1PROG1-tRNA-sgRNA2An-1-tRNA-sgRNA3DEP1-tRNA-sgRNA4D2-tRNA-PolyA-Nos；所述DEP1-gRNAF1的碱基序列如SEQIDNO.23所示；所述D2-tRNAR1的碱基序列如SEQIDNO.24所示；所述D2-gRNAF1的碱基序列如SEQIDNO.25所示；所述PolyA-tRNA-R1的碱基序列如SEQIDNO.26所示；所述DEP1-gRNAF2的碱基序列如SEQIDNO.27所示；所述PolyA-R1的碱基序列如SEQIDNO.28所示； S4利用引物对GW2-gRNAF1、Bh4-tRNAR1和Bh4-gRNAF1、PolyA-tRNA-R1和GW2-gRNAF2、PolyA-R1通过重叠PCR方法获得tRNA-sgRNA5GW2-tRNA-sgRNA6Bh4-tRNA片段；与此同时，利用限制性内切酶PmeI对载体pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-tRNA-sgRNA1PROG1-tRNA-sgRNA2An-1-tRNA-sgRNA3DEP1-tRNA-sgRNA4D2-tRNA-PolyA-Nos进行酶切，并回收酶切产物；最后利用同源重组酶将上述回收产物进行连接获得PROG1+An-1+DEP1+D2+GW2+Bh4六基因组合敲除载体pBUE411-Ubi-NLS-Cas9-NLS-E9-Actin-tRNA-sgRNA1PROG1-tRNA-sgRNA2An-1-tRNA-sgRNA3DEP1-tRNA-sgRNA4D2-tRNA-sgRNA5GW2-tRNA-sgRNA6Bh4-tRNA-PolyA-Nos；所述GW2-gRNAF1的碱基序列如SEQIDNO.29所示；所述Bh4-tRNAR1的碱基序列如SEQIDNO.30所示；所述Bh4-gRNAF1的碱基序列如SEQIDNO.31所示；所述PolyA-tRNA-R1的碱基序列如SEQIDNO.32所示；所述GW2-gRNAF2的碱基序列如SEQIDNO.33所示；所述PolyA-R1的碱基序列如SEQIDNO.34所示。

如需购买、转让、实施、许可或投资类似专利技术，可联系本专利的申请人或专利权人三亚中国农业科学院国家南繁研究院;中国农业科学院作物科学研究所，其通讯地址为：572025 海南省三亚市崖州区崖州湾科技城标准厂房二期三楼C261区；或者联系龙图腾网官方客服，联系龙图腾网可拨打电话0551-65771310或微信搜索“龙图腾网”。