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龙图腾网获悉南方医科大学申请的专利弓形虫gra5基因敲除虫株的构建方法及其应用获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN116121224B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-10-17发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202211516135.4，技术领域涉及：C12N9/22；该发明授权弓形虫gra5基因敲除虫株的构建方法及其应用是由彭鸿娟;杨培;陈敏;辛紫萱设计研发完成，并于2022-11-30向国家知识产权局提交的专利申请。

本弓形虫gra5基因敲除虫株的构建方法及其应用在说明书摘要公布了：本发明属于生物制品技术领域，公开了弓形虫gra5基因敲除虫株的构建方法及其应用。所述构建方法包括GRA5‑5UTR：：DHFR：：GRA5‑3UTR同源模板的制备、靶向切除GRA5的CRISPR质粒的构建和虫株的转化等步骤，从而得到弓形虫gra5基因敲除虫株。采用该构建方法得到的弓形虫gra5基因敲除虫株的安全性好，可抑制包囊的形成，诱导机体产生有效的免疫保护，可制备弓形虫减毒活疫苗用于弓形虫病的防治。此外，该弓形虫gra5基因敲除虫株还能作为抗肿瘤制剂，起到杀灭肿瘤细胞、抑制肿瘤生长的作用。

本发明授权弓形虫gra5基因敲除虫株的构建方法及其应用在权利要求书中公布了：1.一种弓形虫gra5基因敲除虫株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤： GRA5-5UTR：：DHFR：：GRA5-3UTR同源模板的制备：以弓形虫虫株的基因组DNA为模板，根据gra5基因的5’同源臂和3’同源臂分别设计引物，扩增得到GRA5-5UTR片段和GRA5-3UTR片段；以含有DHFR序列的质粒为模板，设计引物扩增得到DHFR片段；采用无缝连接技术连接GRA5-5UTR片段、GRA5-3UTR片段和DHFR片段，得到GRA5-5UTR：：DHFR：：GRA5-3UTR同源模板； 靶向切除GRA5的CRISPR质粒的构建：以CRISPR质粒为模板，采用gra5基因特异靶向的sgRNA进行PCR反应实现定点突变；将所述PCR反应后的产物进行KLD连接；将所述KLD连接后的产物转化入感受态细胞，得到靶向切除GRA5的CRISPR质粒； 虫株的转化：将所述靶向切除GRA5的CRISPR质粒和所述GRA5-5UTR：：DHFR：：GRA5-3UTR同源模板共同电转入弓形虫虫株中，经药检和PCR鉴定，得到弓形虫gra5基因敲除虫株； 所述弓形虫虫株为弓形虫ME49； 其中，用于扩增所述GRA5-5UTR片段的引物的核苷酸序列如SEQIDNO.6-7所示； 用于扩增所述GRA5-3UTR片段的引物的核苷酸序列如SEQIDNO.10-11所示； 所述GRA5-5UTR：：DHFR：：GRA5-3UTR同源模板的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；所述gra5基因特异靶向的sgRNA为sgRNA-GRA5-Fw和sgRNA-GRA5-Rv，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。

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