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龙图腾网获悉中乔健工生物科技(广东)有限公司申请的专利一种加载PD-1抗体的NK细胞外泌体体外培养和分离方法获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN119242578B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-10-21发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202411167921.7，技术领域涉及：C12N5/0783；该发明授权一种加载PD-1抗体的NK细胞外泌体体外培养和分离方法是由赖金林;罗华英设计研发完成，并于2024-08-23向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种加载PD-1抗体的NK细胞外泌体体外培养和分离方法在说明书摘要公布了：本申请公开了一种加载PD‑1抗体的NK细胞外泌体体外培养和分离方法，涉及生物医学技术领域，具体包括如下步骤：1NK细胞培养；2PD‑1抗体加载；3外泌体提取；4外泌体纯化；通过电穿孔实现PD‑1抗体的高效加载，确保抗体在外泌体中的高表达，优化的NK细胞培养条件和外泌体提取流程，保证了外泌体的大规模生产；通过在细胞培养中加入无机颗粒作为微载体，为细胞提供更多的附着点，优化营养物质的传递和代谢废物的清除，提高细胞的增殖倍数，保持细胞活率，提高微载体的整体负载效率和增长量，从而促进NK细胞的生长和增殖，实现细胞的大规模培养。

本发明授权一种加载PD-1抗体的NK细胞外泌体体外培养和分离方法在权利要求书中公布了：1.一种加载PD-1抗体的NK细胞外泌体体外培养和分离方法，其特征在于，具体包括如下步骤： 1NK细胞培养：从健康供体血液中分离出NK细胞，采用RPMI-1640培养基，添加10％胎牛血清、100UmL青霉素和100μgmL链霉素，于37℃、5％CO2的条件下培养；使用IL-2浓度为50IUmL和IL-15浓度为10ngmL刺激NK细胞； 2PD-1抗体加载：将PD-1抗体通过电穿孔法导入NK细胞内，电穿孔参数设置为400Vcm，脉冲时间为10ms；采用免疫荧光法检测PD-1抗体在NK细胞中的表达情况； 3外泌体提取：将培养的NK细胞用PBS洗涤后，重新悬浮于含有无机颗粒的无血清培养基中，无机颗粒与无血清培养基的体积比为2％； 所述无机颗粒包括小粒径10-50μm、中粒径50-150μm和大粒径150-500μm的颗粒，且小粒径颗粒、中粒径颗粒和大粒径颗粒的质量比为1:1:1； 进行间断式搅拌，所述间断式搅拌包括搅拌和沉降，具体为： 初始搅拌以50-100rpm的速度进行，搅拌2-4小时后，停止搅拌，沉降10-30分钟为第一个搅拌循环； 沉降完成后，以40-80rpm的速度进行搅拌，搅拌2-4小时后，停止搅拌，沉降10-30分钟，为第二个搅拌循环； 之后每次循环搅拌皆以30-60rpm的速度进行搅拌，搅拌2-4小时后，停止搅拌，沉降10-30分钟，以此循环直至培养结束； 培养48小时以收集外泌体；使用超速离心法提取外泌体； 其中，所述无机颗粒还包括密度为1.2-3.0gcm3的高密度沉降颗粒、密度为1.0-1.2gcm3的中密度悬浮颗粒和密度小于1.0gcm3的塑料微球低密度漂浮颗粒； 所述高密度沉降颗粒的粒径为50-200μm，所述中密度悬浮颗粒的粒径为10-50μm，所述低密度漂浮颗粒的粒径为1-10μm； 且所述高密度沉降颗粒占无机颗粒总量的30％-40％，所述中密度悬浮颗粒占40％-50％，所述低密度漂浮颗粒占10％-20％； 4外泌体纯化：使用密度梯度离心法进一步纯化外泌体，将外泌体悬浮液层至30％到60％的蔗糖梯度溶液中，以100000g离心16小时，收集外泌体层；采用透析法除去蔗糖，获得纯化的外泌体。

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