电子科技大学附属医院·四川省人民医院钱浩获国家专利权
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龙图腾网获悉电子科技大学附属医院·四川省人民医院申请的专利一种从iPSC分化的细胞中分选成熟RPE细胞的方法及其应用获国家发明授权专利权,本发明授权专利权由国家知识产权局授予,授权公告号为:CN119709618B 。
龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-10-28发布的发明授权授权公告中获悉:该发明授权的专利申请号/专利号为:202411928440.3,技术领域涉及:C12N5/079;该发明授权一种从iPSC分化的细胞中分选成熟RPE细胞的方法及其应用是由钱浩;杨丰铭;胡婧;李瑞;吕欣润设计研发完成,并于2024-12-25向国家知识产权局提交的专利申请。
本一种从iPSC分化的细胞中分选成熟RPE细胞的方法及其应用在说明书摘要公布了:本发明涉及生物技术领域,本发明提出了一种从iPSC分化的细胞中分选成熟RPE细胞的方法及其应用。所述方法中,先诱导iPSC向成熟RPE细胞分化,接着采用Papain和Accutase组合酶温和有效地将细胞分离成单细胞悬液,再用细胞滤网确保细胞为分散且大小合适的单个细胞或小细胞团,最后通过流式细胞仪门控策略和R780‑H通道设置获取高纯度成熟RPE细胞。本发明通过组合酶法使细胞能正常生长和快速增殖,对细胞伤害小;利用R780‑H自发荧光,提高分选准确性和可靠性;细胞消化过滤后可直接进行流式分选,操作简便,减少对细胞的伤害,有利于细胞培养扩增,提高实验效率;依据成熟RPE细胞色素光学特性分选,无需昂贵抗体标记细胞,具有重要应用价值。
本发明授权一种从iPSC分化的细胞中分选成熟RPE细胞的方法及其应用在权利要求书中公布了:1.一种从iPSC分化的细胞中分选成熟RPE细胞的方法,其特征在于,包括如下步骤: S1、对iPSC细胞进行分化,在分化过程中不对细胞进行传代,直至细胞分化至第50-84天,使iPSC分化为RPE细胞; S2、使用DPBS清洗细胞后,加入5-20UmLPapain,37°C消化30-50min,使细胞不再贴壁;消化完成后吸去Papain酶液,加入Accutase进一步消化细胞,37°C消化30-50min,消化结束后加入DPBS,离心弃上清,再加入DPBS重悬细胞,获得细胞悬液; S3、使用35-45μm细胞滤网对细胞悬液进行过滤,获得单细胞悬液;离心弃上清,加入EDTA溶液,使细胞重新悬浮; S4、使用流式细胞仪对细胞进行分选,首先在FSCSSC图上设置门控操作,在流式细胞仪软件的FSCSSC等高图上,根据FSCSSC信号设置第一个门控P1框选细胞,排除细胞碎片和杂质的干扰;然后设置R780-H通道参数;所述参数具体包括,使用638nm波长激发光照射细胞,通过中心波长为780nm、带宽为60nm的带通滤光片,检测750-810nm波长范围内的自发荧光强度;从R780-H通道直方图上将两个主峰的细胞划分开,荧光相对较低的细胞群体使用P2门进行框选,荧光相对较高的细胞群体使用P3门进行框选,通过P2和P3门对细胞进行分选,P3门收集的细胞即为成熟RPE细胞; 所述荧光相对较高为如下1-2中的一种: 1当细胞在R780-H荧光通道下分为两群时,荧光强度高的细胞群体; 2当细胞在R780-H荧光通道下未分为两群时,荧光强度高于无色素对照细胞的细胞群体。
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