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龙图腾网获悉山东大学申请的专利一种敲除基因的微小小单胞菌及其构建方法与应用获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN119639643B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-11-11发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202411937280.9，技术领域涉及：C12N1/21；该发明授权一种敲除基因的微小小单胞菌及其构建方法与应用是由谷秀凤;冯强;高海婷设计研发完成，并于2024-12-26向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种敲除基因的微小小单胞菌及其构建方法与应用在说明书摘要公布了：本发明涉及一种敲除基因的微小小单胞菌及其构建方法与应用。所述敲除基因的微小小单胞菌是将微小小单胞菌基因组中的appa基因敲除后构建得到。所述构建方法是：1获取待敲除基因appa的上游同源臂片段和下游同源臂片段；2获取ermB抗性基因片段；3将上游同源臂片段、ermB抗性基因和下游同源臂片段按顺序连接；4通过自然转化将融合DNA片段转化至微小小单胞菌中；3筛选后得到敲除目标基因appa的微小小单胞菌。本发明首次采用自然转化的方法实现了微小小单胞菌的基因敲除，有效克服了微小小单胞菌难以进行转化和基因编辑的问题。所构建的敲除基因appa的微小小单胞菌可用于研究牙周膜干细胞hPDLSCs自噬机制。

本发明授权一种敲除基因的微小小单胞菌及其构建方法与应用在权利要求书中公布了：1.一种敲除appa基因的微小小单胞菌的构建方法，其特征在于，是将微小小单胞菌基因组中的appa基因敲除后构建得到；所述appa基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示； 所述的敲除appa基因的微小小单胞菌的构建方法，包括步骤如下： 1以微小小单胞菌基因组为模板，设计引物，通过PCR扩增，得到待敲除基因appa的上游同源臂片段和下游同源臂片段； 2人工合成ermB抗性基因模板，设计引物，通过PCR扩增，得到ermB抗性基因片段； 3通过overlapPCR方法，将上游同源臂片段、ermB抗性基因和下游同源臂片段按顺序连接，得到融合DNA片段； 4将融合DNA片段溶于双蒸水中，得到浓度为0.01~0.1μgμL融合DNA片段溶液；然后将融合DNA片段溶液滴加至BHI固体培养基上，静置24h，得到含有融合DNA片段的培养基； 将微小小单胞菌菌液划线接种在BHI固体培养基上，在厌氧培养箱中培养3~5天至长出单菌落；使用一次性接种环从BHI固体培养基中收集微小小单胞菌，接种于含有1mL的BHI液体培养基中，旋转定量环，以促进细菌释放到培养基中，调节细胞悬液浓度至OD600=0.4，得到微小小单胞菌菌悬液；然后将20μL微小小单胞菌菌悬液滴加至含有融合DNA片段的培养基上，在37℃的厌氧条件下培养36h，使得融合DNA片段转化至微小小单胞菌中； 5将转化后的微小小单胞菌涂布到含有红霉素的BHI固体培养基上继续培养5天，得到突变转化子；利用引物4F4R筛选鉴定转化子，得到敲除appa基因的微小小单胞菌。

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