博雅干细胞科技有限公司魏卿获国家专利权
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龙图腾网获悉博雅干细胞科技有限公司申请的专利培养脂肪间充质干细胞制备外泌体获国家发明授权专利权,本发明授权专利权由国家知识产权局授予,授权公告号为:CN115478048B 。
龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-11-14发布的发明授权授权公告中获悉:该发明授权的专利申请号/专利号为:202211289928.7,技术领域涉及:C12N5/0775;该发明授权培养脂肪间充质干细胞制备外泌体是由魏卿;肖海蓉;刘庆喜设计研发完成,并于2022-10-21向国家知识产权局提交的专利申请。
本培养脂肪间充质干细胞制备外泌体在说明书摘要公布了:本发明涉及培养脂肪间充质干细胞制备外泌体。一方面,本发明涉及使用脂肪间充质干细胞分离提取的外泌体,其具有50~200nm的平均粒径,膜蛋白CD9的阳性表达率大于70%,膜蛋白CD81的阳性表达率大于80%;该外泌体是使用IL‑1β处理脂肪间充质干细胞然后在低氧分压的环境中对细胞进行培养,接着通过对培养液进行差速离心制备得到的。本发明还提供上该外泌体的制备方法,其医疗用途。本发明外泌体具有优良的生物调控性能和生物学活性。
本发明授权培养脂肪间充质干细胞制备外泌体在权利要求书中公布了:1.使用脂肪间充质干细胞分离提取外泌体的方法,该方法包括如下步骤: 1将间充质干细胞接种至培养瓶中,添加MSC完全培养基,置37℃、5%CO2培养箱中培养使细胞贴壁,再向培养液中添加IL-1β、酒石酸钠、盐酸赖氨酸分别至浓度8~12ngmL、0.125~0.175mgmL、2.0~2.5mgmL,继续培养; 2吸弃培养基,更换为新鲜的MSC完全培养基,使细胞继续于37℃、5%CO2培养箱中培养直至细胞融合度≥80%; 3吸弃培养基,用PBS清洗,然后添加MSC完全培养基,再置于37℃、2%O2、5%CO2培养箱中培养42~56小时; 4吸取细胞上清液置离心管中,进行如下离心处理: 以250~350g、4℃离心8~12分钟,吸取上清液至另一离心管中; 以1500~2500g、4℃离心18~25分钟,吸取上清液至另一离心管中; 以8000~12000g、4℃离心25~35分钟,上清液用0.22μm滤膜过滤后置于另一离心管中; 以80000~120000g、4℃离心75~120分钟,弃上清; 5向离心管中添加无菌PBS使外泌体沉淀重悬,以80000~120000g、4℃离心75~120分钟,弃上清液,加无菌PBS使外泌体重悬,得到呈悬液形式的外泌体, 其中,所述脂肪间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的: a在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的脂肪样本; b使脂肪样本离心,移取上层脂肪组织,再使用D-Hanks液清洗一遍,再次离心,移取脂肪组织,加入1%Ⅱ型胶原酶振荡消化;本步骤中,两次离心均以100g离心5min的条件进行操作,加入2倍体积的1%Ⅱ型胶原酶振荡消化30min; c消化结束后,加一倍体积D-hanks液稀释,离心,留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作; d取步骤c所得细胞沉淀,加入原代增补培养基重悬,取样计数,按照规定细胞量接种至培养瓶;置CO2培养箱中培养;所述原代增补培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并加入:1%血小板裂解物、1%人血白蛋白、2μgml重组胰岛素、15ngml的EGF、25ngml的bFGF、0.12%硫代甘油、1%果糖; e培养3d后培养基全换液一次,至细胞融合度达80%以上后,去旧培养基,用D-hanks液清洗细胞,每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min,使细胞脱落,每瓶加入10ml的D-hanks液稀释,100g离心10min,将细胞沉淀用原代增补培养基重悬,即得原代脂肪间充质干细胞; f使原代脂肪间充质干细胞以步骤d至步骤e的方式纯化培养和传代,得P1代细胞;以此类推,依次得到P2~P8代间充质干细胞。
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