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龙图腾网获悉四川农业大学申请的专利18β-甘草次酸对高脂日粮诱导线粒体功能损伤所介导肝损伤的研究方法获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN119915788B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-11-21发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202510068376.4，技术领域涉及：G01N21/64；该发明授权18β-甘草次酸对高脂日粮诱导线粒体功能损伤所介导肝损伤的研究方法是由赵菊;姜俊;刘海峰;曹全全;杨中杰;李小清设计研发完成，并于2025-01-16向国家知识产权局提交的专利申请。

本18β-甘草次酸对高脂日粮诱导线粒体功能损伤所介导肝损伤的研究方法在说明书摘要公布了：本发明公开了18β‑甘草次酸对高脂日粮诱导线粒体功能损伤所介导肝损伤的研究方法，包括以下步骤，S1试验设计，S2试验样品采集，S3指标测定，S4试验数据统计分析，S5结果，首次探索了18β‑甘草次酸18β‑glycyrrhetinicacid,GA可通过下调TGFβ1‑Smad23信号降低肝脏胶原纤维的聚集来缓解肝脏纤维化，从而改善高脂日粮HF导致的大口黑鲈肝损伤，其次，GA可通过激活Ampk‑Pgc1α‑Sirt3信号通路来降低内质网和线粒体中钙离子转运蛋白的表达，缓解肝脏线粒体损伤而减少ROS的含量，从而抑制促纤维化因子的激活，HF会上调大口黑鲈肝功能相关酶的活力，增加肝脏脂滴沉积，胶原的聚集，而添加GA后会明显改善HF所导致的不良影响，从而来缓解HF诱导的大口黑鲈肝损伤。

本发明授权18β-甘草次酸对高脂日粮诱导线粒体功能损伤所介导肝损伤的研究方法在权利要求书中公布了：1.18β-甘草次酸对高脂日粮诱导线粒体功能损伤所介导肝损伤的研究方法，包括以下步骤，其特征在于： S1试验设计，S11试验日粮：基础饲料包含三种蛋白质来源鱼粉、鸡肉粉和发酵豆粕，以豆油为脂肪源，以及两种碳水化合物，小麦粉和木薯淀粉，分别配制对照组，蛋白水平为47.75%，脂肪水平为9.05%、高脂日粮组，蛋白水平为47.31%，脂肪水平为16.29%、高脂日粮加GA0.5mgkg，蛋白水平为47.48%，脂肪水平为16.25%、高脂日粮加GA1.0mgkg，蛋白水平为47.48%，脂肪水平为16.44%和高脂日粮加GA1.5mgkg，蛋白水平为47.55%，脂肪水平为16.44%，维生素和矿物质预混料添加量分别为1%和1.5%，维生素D、维生素C、硒，饲料原料全部经过粉碎，过40目筛，按配比称量，微量成分采取逐级扩大法添加，并与大宗原料混合均匀，加油和水后再次均匀混合，用小型膨化饲料机制粒，于30℃烘干，储存于密封塑料袋中，概略养分分析各饲料营养成分后用于实验； S12试验鱼与饲养管理：试验鱼是健康大口黑鲈，暂养2周后，将750尾平均初始体重为17.39±0.09g健康大口黑鲈，随机分配到15个方形水泥池中，每个水泥池50尾，水泥池被随机分为5个处理组，分别投喂NC组、HF组、HFL组、HFM组和HFH组饲料，每个处理设3个重复，生长试验为期77天，每天上午7:30和下午18:00进行饱食投喂，在投饵40min后，对其剩余的残饵捞出，烘干并称重，每天记录天气、水温、投饵率、残饵量和摄食量等，试验采用微流水养殖方式，水流速度维持在1.0Lmin，试验期水温为25.0±3.0℃，间歇性增氧，保持溶氧大于5.0mgL； S2试验样品采集，在饲养试验结束后，对大口黑鲈禁食24h，每个重复选取体重大致相近的12尾鱼用0.01%MS-222麻醉，待鱼体擦干之后，称重并记录体重，用抗凝剂润洗过的1.5mL一次性注射器尾静脉取血，其中9尾大口黑鲈分离躯体和内脏后，迅速从内脏团中分离肝脏，再用生理盐水彻底清洗，拍照，称重并记录肝重后，装入到贴有相应标签的袋子中，再用锡箔纸包好后，立即放入液氮中冷冻，之后迅速转入-80℃超低温冰箱中保存，用于后续试验指标测定，剩余3尾大口黑鲈，分离肝脏组织，用4%的中性福尔马林对肝组织进行固定，用于后续的HE染色、Masson染色和免疫荧光染色分析，同样的方法，取冰冻切片样放入2mL冻存管中，写上标签后，用锡箔纸包好后立即置于液氮中冷冻，用于后续的油红O染色，电镜样则取黄豆大小的组织固定于2.5%戊二醛溶液中，用于透射电镜切片观察； S3指标测定 S31肝体比； S32血液和肝脏生化指标的测定； S33肝脏Hamp;E染色分析； S34肝脏油红O染色分析； S35肝脏Masson染色分析； S36肝脏透射电镜分析； S37肝脏免疫荧光分析； S38活性氧检测； S39膜电位MMP测定； S310实时定量PCR检测； S3101RNA提取和cDNA合成； S3102实时荧光定量引物设计； S3103实时荧光定量检测基因表达水平：将每个处理的3个cDNA样品按1:1稀释，然后检测纤维化相关基因：Tgfβ1a、Smad2、Smad3a、α-Sma、CollagenⅠ、Fibronectin和Mmp9；线粒体钙离子转运相关基因：Ampkα1、Pgc1α、Sirt3、Ip3r1、Sig1r1、Casr、Grp75、Vdac1、Mcu，采用TBGreen™PremixExTaq™IITliRNaseHPlus试剂盒进行荧光定量PCR扩增，将10倍连续稀释的阳性模板作为PCR模板，然后做标准曲线，扩增效率在90%-110%，R20.9，溶解曲线成单一峰，采用10μLPCR扩增体系：3.2μLDEPC水，1μLcDNA模板，上游引物和下游引物各0.4μL以及5μLSYBRPremixExTaqⅡ，反应循环条件：95℃预热2min，循环40次的95℃10s和适宜退火温度30s，反应完成后利用溶解曲线检测产物特异性； S3104相对定量计算； S311蛋白质免疫印迹； S4试验数据统计分析； S5结果 S51GA对HF诱导的大口黑鲈肝损伤的影响，其包括以下步骤： S511肝体比：通过解剖观察肝脏外观和统计大口黑鲈肝体比，发现NC组肝脏表面光滑，红润，与NC组相比，HF组肝体比显著提高，GA处理降低了肝体比； S512血液和肝功能参数：检测了大口黑鲈血液学和肝功能，HF组血清AST、ALT和AKP活性显著高于NC组，与NC组相比，HF组中MDA含量显著增加，GA降低了HF诱导的血清中的AST、ALT和AKP活力，TG、TC含量和肝脏中的MDA含量，增加GST活力，从而缓解HF诱导肝损伤； S513肝脏组织病理学：与NC组相比，HF组肝细胞明显肿胀，细胞核出现边缘移位，部分甚至消失，数量较少，与HF组相比，GA处理组中肝脏脂肪变性逐渐有所缓解，细胞核数量逐渐增加，位于细胞中央，GA降低了HF诱导肝脏脂质变性和脂滴沉积； S52GA对HF诱导的大口黑鲈肝脏纤维化的影响：检测血清中HYP的含量，发现与NC组相比，HF组大口黑鲈血清中HYP含量显著增加，而与HF组相比，GA给药显著降低HYP含量； S521GA对HF诱导的与HSC激活相关的促纤维化标志物的转录的影响：进一步检测了促纤维化标志物α-SMA、CollagenI、Fibrontein和Mmp9的mRNA表达，Western-blot方法检测了α-SMA、CollagenI和Fibrontein的蛋白水平，GA可有效减轻HF诱导的大口黑鲈肝纤维化； S522GA对HF诱导大口黑鲈肝脏Tgfβ1-Smad23信号通路的影响：检测了Tgfβ1a及其靶蛋白Smad2和Smad3a的mRNA表达，Western-blot方法检测了Tgfβ1、p-Smad2和p-Smad3蛋白水平，GA通过调控Tgfβ1介导的Smad23信号通路来改善肝纤维化； S53GA对HF诱导肝脏线粒体的影响，其包括以下步骤： S531GA对HF诱导的肝脏活性氧的影响：进一步检测线粒体功能相关指标MMP和ATP含量，DCFH-DA检测ROS，GA处理可减轻HF诱导的大口黑鲈肝脏线粒体损伤； S532GA对HF诱导的肝脏线粒体损伤的影响：GA处理恢复了这些特征，与NC组非常相似； S54GA对HF诱导的肝脏胞浆和内质网Ca2+和钙离子转运蛋白的表达的影响：Western-blot检测了Ip3r1的蛋白水平，发现与NC相比，HF组中IP3R1的蛋白水平最高，而GA处理后IP3R1的蛋白水平有所降低； S55GA对HF诱导的肝脏线粒体钙离子转运蛋白mRNA表达和蛋白水平的影响：评估了Grp75、Vdac1和Mcu的表达，对肝脏Vdac1和Mcu蛋白水平进一步的分析，这些蛋白水平在HF组中显着增加，在HF组和GA处理组中，Grp75蛋白水平相对未受影响； S56GA对HF诱导的Ampk-Pgc1α-Sirt3信号通路的影响：通过检测Ampk、Pgc1α和Sirt3的mRNA表达，GA升高了HF降低的肝脏Sirt3水平，GA通过调节Sirt3的表达来降低肝脏Mcu的表达。

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