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龙图腾网获悉华中农业大学申请的专利负载抗原的PHA纳米颗粒的表达质粒系统及制备和应用获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN120272508B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-11-21发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202510769773.4，技术领域涉及：C12N15/70；该发明授权负载抗原的PHA纳米颗粒的表达质粒系统及制备和应用是由韩丽;杜生磊;刘维巍;李龙;刘思源;曹绮雯;张蕾蕾;张安定设计研发完成，并于2025-06-10向国家知识产权局提交的专利申请。

本负载抗原的PHA纳米颗粒的表达质粒系统及制备和应用在说明书摘要公布了：本发明公开了一种负载抗原的PHA纳米颗粒的表达质粒系统及制备和应用。包括pACYC‑PhaA‑PhaB质粒和pET28a‑PhaC‑Target质粒，其核苷酸序列分别如SEQIDNO：4和SEQIDNO：5所示；所述pACYC‑PhaA‑PhaB质粒为在载体pACYCDuet‑1的多克隆位点插入分别由两个T7启动子启动的PhaA和PhaB蛋白表达框；所述pET28a‑Phac‑Target质粒是在载体pET‑28a的多克隆位点插入PhaC‑疫苗抗原融合蛋白表达框。本发明为制备PHA纳米颗粒疫苗和相关研究奠定了良好的基础。

本发明授权负载抗原的PHA纳米颗粒的表达质粒系统及制备和应用在权利要求书中公布了：1.一种利用负载抗原的PHA纳米颗粒的表达质粒系统制备负载抗原的PHA纳米颗粒的方法，其特征在于：所述表达质粒系统包括pACYC-PhaA-PhaB质粒和pET28a-PhaC-Afua质粒；其中， 所述pACYC-PhaA-PhaB质粒和pET28a-PhaC-Afua质粒的核苷酸序列分别如SEQIDNO：4和SEQIDNO：11所示； 所述pACYC-PhaA-PhaB质粒为在载体pACYCDuet-1的多克隆位点插入分别由两个T7启动子启动的PhaA和PhaB蛋白表达框； 所述pET28a-PhaC-Afua质粒是在载体pET-28a的多克隆位点插入PhaC-疫苗抗原融合蛋白表达框； 所述疫苗抗原融合蛋白为Afua蛋白，Afua蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示； 所述PhaA、PhaB及PhaC的核苷酸序列分别如SEQIDNO：1、SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示； 包括以下步骤： 1将pACYC-PhaA-PhaB质粒和pET28a-PhaC-Afua质粒电转到大肠杆菌RosettaDE3感受态细胞中，经过抗性筛选获得重组菌株的单菌落； 2将单菌落接入含有卡那霉素和氯霉素的LB培养基中，震荡培养； 3将步骤2培养的菌液转接入含有卡那霉素、氯霉素和葡萄糖的LB培养基中，震荡培养至OD600=0.6~0.8；加入IPTG后震荡培养； 4将步骤3培养的菌液离心获得沉淀，沉淀中加入Trisbuffer重悬，进行超声破碎细胞，离心获得沉淀； 5将步骤4获得的沉淀依次用PHA纯化缓冲液组合中PHA纯化缓冲液A和PHA纯化缓冲液B重悬和离心，然后进行孵育，离心获得沉淀，最后用PHA纯化缓冲液组合中PHA纯化缓冲液C重悬，离心获得沉淀； 6将步骤5最终获得的沉淀用Trisbuffer重悬，获得负载抗原的PHA纳米颗粒； 所述步骤1中，所述抗性筛选的抗生素为终浓度0.05mgmL氯霉素和终浓度0.05mgmL的组合； 所述步骤2中，LB培养基中，卡那霉素浓度为0.05mgmL，氯霉素浓度为0.05mgmL，37℃，220rpm震荡培养8~10h； 所述步骤3中，LB培养基中，卡那霉素浓度为0.05mgmL，氯霉素浓度为0.05mgmL，葡萄糖的浓度为0.01~0.1gmL，震荡培养的条件为37℃，220rpm；加入IPTG的终浓度为0.1~1.6mM，加入IPTG后震荡培养条件为16~37℃、200rpm、8~24h； 所述步骤5中，孵育1~1.5h； 所述PHA纯化缓冲液A包括1.21gL的Tris、1.46gL的乙二胺四乙酸、0.4gL的尿素，pH为11； 所述PHA纯化缓冲液B包括1.21gL的Tris、1.46gL的乙二胺四乙酸EDTA，120gL的尿素，20mLLTritonX-100，pH为7.5； 所述PHA纯化缓冲液C包括1.21gL的Tris，pH为7.5； 所述Trisbuffer包括2.42gL的Tris和8.76gL的NaCl，pH为7.4。

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