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龙图腾网获悉天津科技大学申请的专利一种合成乳酰-N-新四糖且安全的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN119662501B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-12-19发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202411814667.5，技术领域涉及：C12N1/21；该发明授权一种合成乳酰-N-新四糖且安全的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用是由高伟霞;胡少茹;赵紫逸设计研发完成，并于2024-12-11向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种合成乳酰-N-新四糖且安全的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用在说明书摘要公布了：本发明属于基因工程技术领域，公开了一种合成乳酰‑N‑新四糖且安全的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用，所述重组枯草芽孢杆菌是在枯草芽孢杆菌168中转化包含β‑1,3‑N‑乙酰葡糖胺基转移酶、β‑1,4‑半乳糖基转移酶基因和乳糖透性酶基因的质粒得到的。本发明针对现有技术中市场对乳酰‑N‑新四糖的巨大需求，而现有大多数工程菌所生产的乳酰‑N‑新四糖存在不安全性，提供一种用于生产乳酰‑N‑新四糖的工程菌与应用，来满足市场对乳酰‑N‑四糖的需求。

本发明授权一种合成乳酰-N-新四糖且安全的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用在权利要求书中公布了：1.一种合成乳酰-N-新四糖且安全的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述重组枯草芽孢杆菌是在枯草芽孢杆菌168中转化包含β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶、β-1,4-半乳糖基转移酶基因和乳糖透性酶基因的质粒得到的； 其中，所述β-1,4-半乳糖基转移酶基因的序列为SEQIDNO.1、β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶的序列为SEQIDNO.2、乳糖透性酶基因的的序列为SEQIDNO.3； 所述质粒为pHT01； 所述β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶来源于脑膜炎双球菌，β-1,4-半乳糖基转移酶基因来源于A.actinomycetemcomitansNUM4039，乳糖透性酶基因来源于大肠杆菌； 所述重组枯草芽孢杆菌是在枯草芽孢杆菌168进一步地对glmS编码葡糖胺-6磷酸合酶使用强启动子Pc2up，并且导入trp终止子以有效地解除glmS核酶反馈抑制得到的，并且转化包含β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶、β-1,4-半乳糖基转移酶基因和乳糖透性酶基因的质粒得到的； 所述的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤： 使用枯草芽孢杆菌化学感受态细胞制备及转化方法，将重组质粒pHT01-Aa-β-1,4-galT-lgtA-lacY转入枯草芽孢杆菌168中，涂布10µgmL氯霉抗性平板，37℃培养12h，挑取转化子进行菌落PCR，出现3573bp条带，验证重组枯草芽孢杆菌构建成功； 所述重组质粒pHT01-Aα-β-1,4-galT-lgtA-lacY的构建方法，包括如下步骤： 根据NCBI上公布的A.actinomycetemcomitansNUM4039中的β-1,4-半乳糖基转移酶基因BAS48030.1，通过枯草芽孢杆菌偏好密码子优化后，合成如SEQIDNO.1所示的基因序列； 使用引物Aα-β-1,4-galT-F和Aα-β-1,4-galT-R，以合成的基因序列为SEQIDNO.1的β-1,4-半乳糖基转移酶基因为模板扩增Aα-β-1,4-galT片段，将所述基因Aα-β-1,4-galT的序列片段克隆到载体pHT01上，构建质粒pHT01-Aα-β-1,4-galT； 根据NCBI上公布的脑膜炎双球菌NeisseriameningitidisMC58中的β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶基因GeneID:904226通过枯草芽孢杆菌偏好密码子优化后，合成如SEQIDNO.2所示的基因序列； 使用引物lgtA-F和lgtA-R，以合成的基因序列为SEQIDNO.2的β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶基因为模板扩增lgtA片段，将所述基因lgtA的序列片段克隆到载体pHT01-Aα-β-1,4-galT上，构建质粒pHT01-Aα-β-1,4-galT-lgtA； 根据NCBI上公布的大肠杆菌EscherichiacoliK12中的乳糖透性酶基因GeneID:949083通过枯草芽孢杆菌偏好密码子优化后，合成如SEQIDNO.3所示的基因序列； 使用引物lacY-F和lacY-R，以合成的基因序列为SEQIDNO.3的乳糖透性酶基因为模板扩增lacY片段，将所述基因lacY的序列片段克隆到载体pHT01-Aα-β-1,4-galT-lgtA上，构建质粒pHT01-Aα-β-1,4-galT-lgtA-lacY； 所述的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤： 利用CRISPR-Cas9技术，在glms位点前无痕敲入合成的序列为SEQIDNO.4强启动子Pc2up和序列为SEQIDNO.5trp终止子； 使用质粒为pJOE8999，选择glmS的氨基酸序列，通过http:chopchop.cbu.uib.no网站对比预测的N20序列；N20片段是由引物glms即N20-F和glms即N20-R通过95℃变性后降温持续复性得到，将pJOE8999质粒进行Bas1酶切，连接N20片段； 下一步在连接了N20片段的质粒上sal1酶切位点引入修复模板即上游同源臂-trp终止子-启动子Pc2up-下游同源臂，进行同源重组实现染色体修复时，将trp终止子和Pc2up启动子基因插入枯草芽孢杆菌168glmS基因前；上下同源臂是用引物glms-UP-F、glms-UP-R、glms-DN-F、glms-DN-R以枯草芽孢杆菌168为模板以PCR扩增技术得到，强启动子Pc2up片段是用Pc2up-F、Pc2up-R引物以PCR扩增技术得到，其中trp终止子是通过引物glms-UP-R、Pc2up-F扩增；上游同源臂-trp终止子-启动子Pc2up-下游同源臂以引物glms-UP-F、glms-DN-R进行重叠PCR同源重组得到；将连接了N20片段的质粒上进行sal1酶切与上游同源臂-trp终止子-启动子Pc2up-下游同源臂连接，glms敲入质粒的构建成功； 将构建成功的glms敲入质粒化转至枯草芽孢杆菌168中，将其涂板于含有5μgmL卡那霉素和质量百分数0.2%甘露糖的LB平板上，在甘露糖诱导型启动子P的控制下诱导cas9基因，30℃培养箱下培养至长出单菌落；然后，将长出的菌落用牙签点于不含kana的LB平板上，并在37℃下培养；第二天，将菌落划线于LB平板上在42℃下获得更多的单菌落；最后将菌落用牙签点于含有5μgmLkana和不含kana的LB平板上，筛选出LB平板上长菌落，抗性平板上不长菌落的转化子；使用引物glms-F和glms-R进行PCR验证，出现1935bp，glms敲入菌株构建成功；将重组质粒pHT01-Aα-β-1,4-galT-lgtA-lacY转入上述glms敲入菌株中，涂布10µgmL氯霉抗性平板，37℃培养12h，挑取、转化子进行菌落PCR，出现3573bp条带，验证重组枯草芽孢杆菌BA03构建成功； 重组枯草芽孢杆菌合成乳酰-N-新四糖的产量，摇瓶得到3.5gL，5L发酵罐得到9.6gL。

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