苏州大学杨霜获国家专利权
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龙图腾网获悉苏州大学申请的专利一种基于固相糖蛋白T抗原糖肽富集和酶切分析的方法获国家发明授权专利权,本发明授权专利权由国家知识产权局授予,授权公告号为:CN114720543B 。
龙图腾网通过国家知识产权局官网在2026-02-24发布的发明授权授权公告中获悉:该发明授权的专利申请号/专利号为:202210357748.1,技术领域涉及:G01N27/62;该发明授权一种基于固相糖蛋白T抗原糖肽富集和酶切分析的方法是由杨霜;徐明明;岳爽设计研发完成,并于2022-04-06向国家知识产权局提交的专利申请。
本一种基于固相糖蛋白T抗原糖肽富集和酶切分析的方法在说明书摘要公布了:本发明公开了一种基于固相糖蛋白T抗原糖肽富集和酶切分析的方法,包括步骤:从样本中提取蛋白;蛋白酶解获得多肽;半乳糖和N‑乙酰半乳糖氧化;酰肼树脂固定与PNGaseF酶切;半乳糖苷酶处理与质谱分析。该方法获得三种结构,核心1的T抗原糖肽、核心2糖肽、核心8糖肽。T抗原糖肽和核心2糖肽通过质谱分析区别,而T抗原糖肽与核心8通过不同糖苷酶区别。本方法可以富集并区分含T抗原、核心2和核心8的糖肽,对发现肿瘤组织和体液中具有T抗原修饰的特异性标志物,以及疾病早期诊断和预后标志物的研究等方面有着重要意义。
本发明授权一种基于固相糖蛋白T抗原糖肽富集和酶切分析的方法在权利要求书中公布了:1.一种基于固相糖蛋白T抗原糖肽富集和酶切分析的方法,其特征在于,包括步骤: 1从样本中提取蛋白; 2蛋白酶解获得多肽: ①向蛋白溶液中加入二硫苏糖醇,在温度为37°C的条件下反应1-1.5小时; ②再加入碘乙酰胺,室温暗室反应0.5-1小时,获得样本; ③将所述样本稀释,加入碳酸氢铵,直至所述碳酸氢铵的终浓度为90-110mM,所述样本的pH值介于7-9之间; ④加入测序级胰蛋白酶,轻微振荡,在温度为37°C的条件下水解16-18小时,得到多肽溶液; ⑤在所述多肽溶液中加入甲酸,直至pH值下调至2-3; ⑥将C18萃取柱预处理,向所述C18萃取柱中加入所述多肽溶液,将过滤液再次加入所述C18萃取柱,用0.1%TFA清洗所述C18萃取柱多次,最后,用含有0.1%TFA的50-60%乙腈洗脱出多肽,并且重复多次; ⑦将洗脱出的多肽合并,真空冷冻干燥得到纯化的多肽; 3半乳糖和N-乙酰半乳糖氧化:向所述纯化的多肽中加入二甲基亚砜、磷酸钠缓冲液、辣根过氧化物酶以及半乳糖氧化酶,然后在温度为35°C的条件下反应0.9-1.1小时,获得糖肽,其中,所述二甲基亚砜、磷酸钠缓冲液、辣根过氧化物酶以及半乳糖氧化酶的体积比为9-11:22-23:12-13:4-6; 4酰肼树脂固定与PNGaseF酶切; 5半乳糖苷酶处理与质谱分析: ①向树脂中加入去离子水、50-60mM磷酸钠缓冲液和β半乳糖苷酶,在温度为37°C的条件下反应1小时,以切断T抗原中半乳糖和乙酰半乳糖胺之间的连接,获得含T抗原和核心2修饰位点的多肽,其中,所述去离子水、磷酸钠缓冲液和β半乳糖苷酶的体积比为156-160:38-42:1.8-2.2; ②向β半乳糖苷酶处理后的树脂中加入a半乳糖苷酶,以切断半乳糖-a1-3-乙酰半乳糖胺中半乳糖和乙酰半乳糖胺的连接,得到含核心8的多肽。
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