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龙图腾网获悉中国药科大学申请的专利一种基于无需荧光图像的高通量抗纤维化药物筛选方法及其应用获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN119479897B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2026-03-24发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202411581821.9，技术领域涉及：G16C20/50；该发明授权一种基于无需荧光图像的高通量抗纤维化药物筛选方法及其应用是由杨华;李萍;邢绪东;严翔宇设计研发完成，并于2024-11-07向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种基于无需荧光图像的高通量抗纤维化药物筛选方法及其应用在说明书摘要公布了：本发明公开了一种基于无需荧光图像的高通量抗纤维化药物筛选方法及其应用，涉及生物医药技术领域，本发明为了获得一种可用于大规模药物筛选的快速简便的方法，本发明通过高内涵仪器采集NIH3T3细胞的DPC图像，通过自带分析软件得到的形态学参数与α‑SMA蛋白的表达量做相关性分析，筛选出13个与α‑SMA蛋白表达量高相关的13个形态学参数与人工智能方法相结合用于大规模药物筛选，该方法具有高通量、高准确度、操作简便、可用于判断药物是否具有抗纤维化效果等优势，能够提高检测效率，可应用于预测中药单体是否具有抗纤维作用，此方法证明了其作为抗纤维化药物筛选的准确性与有效性，为未来的药物开发和纤维化疾病的治疗提供了重要的实验依据和技术支持。

本发明授权一种基于无需荧光图像的高通量抗纤维化药物筛选方法及其应用在权利要求书中公布了：1.一种基于无需荧光图像的高通量抗纤维化药物筛选方法，其特征在于：包括以下步骤； 步骤一：采集0.1ngml、0.5ngml、1ngml、5ngml、10ngml不同浓度的TGF-βI刺激下DPC成像和荧光成像； 步骤二：在相同TGF-βI浓度10ngmL下，不同时间3h、6h、12h、24h、36h进行DPC成像参数和α-SMA荧光成像采集； 步骤三：SD-208是一种选择性TGF-βI抑制剂，该部分采用DPC成像技术对NIH3T3在50nM、25nM、10nM、5nM、1nM不同浓度SD-208下进行成像，同时，对α-SMA进行免疫荧光成像； 步骤四：高内涵成像方法的构建； 步骤五：明场数字相差成像DPC方法建立； 步骤六：基于“机器学习”技术辅助的图像分析方法建立； 步骤七：10种天然药物活性化合物抗纤维化检测； 1Resveratrol白藜芦醇501-36-0 2Matairesinol罗汉松脂素580-72-3 3Catechol儿茶酚120-80-9 4Neo-przewaquinoneA新对苯二酚A630057-39-5 5SalvianolicacidF丹酚酸F158732-59-3 6EupalinolideO欧帕利内酯O2170228-67-6 7PlatycodinD欧帕利内酯O58479-68-8 8Isolinderalactone异乌药内酯957-66-4 9Alantolactone土木香内酯546-43-0 10EupalinolideA欧帕利内酯A877822-40-7 配置1μM、5μM、10μM、20μM的10种化合物作用于NIH3T3细胞24h； 根据以上筛选标准，对不同浓度TGF-βI、不同时间TGF-βI和不同浓度靶点抑制剂SD-208影响下的DPC参数进行了线性相关分析后，通过分析相关系数大于0.3的不同组参数之间的关系，包括：CellArea、CellDigitalPhaseContrastSERBright0px、CellDigitalPhaseContrastSERHole0px、CellDigitalPhaseContrastSERRidge0px、CellLength、CellRadialMean、CellRoundness、CellSymmetry05、CellSymmetry15、CellThresholdCompactness30％、CellThresholdCompactness40％、CellThresholdCompactness50％、CellThresholdCompactness60％在内的共有13个DPC参数为常见扰动参数，这些参数将用于扰动机理预测； 步骤四中，高内涵成像方法的构建： 1基于细胞形态学分析软件参数的处理方式； 2提出的深度学习和无偏筛选方法将商业软件的处理参数与基于图像的神经网络“机器学习”分割网络、预处理模块和分类网络相结合，对化合物的活性进行区分； 细胞形态学分析软件参数的提取： 该部分使用Harmony4.9软件进行分析；高内涵成像系统生成3通道输出图像，其中一个通道为明场成像，另外三个通道为荧光成像；通过软件进行计数，然后通过内置算法提取细胞形态参数；采用Harmony4.9软件对NIH3T3细胞的DPC图像进行分析，得到33个形态学参数；这些形态参数和a-SMA荧光强度被分析用于后续实验；本部分采用线性回归分析来区分DPC图像与a-SMA蛋白荧光值的相关性分析；DPC参数之间进行线性相关分析； “机器学习”数据处理： 采用InceptionV4架构的神经网络对图像进行分类，初始输入是一个16位图像，包含一个明场通道和一个DPC通道；首先调整原始图像的每个通道的大小并标准化，然后用现有两个通道的平均值生成第三个通道，以形成RGB图像，并将299×299×3图像输入到InceptionV4网络中；将倒数第二个全连通层的输出维数修改为6，将细胞图像分为6种类型；Inceptionv4架构神经网络在ImageNet对象识别数据集上进行了预训练，该数据集包含1000个类别的120万个非单元对象，使用预先训练好的卷积层，将它们与随机初始化的全连接层连接起来，并在构建的数据集上训练得到的网络； 以TGF-βI为造模剂，在培养NIH3T3细胞的孔中加入0.01μM、0.10μM、1μM、5μM、10、20μ不同浓度的MTGF-βI处理的细胞分别被标记为1-5型，定义0型和1型细胞为正常细胞，2型和3型细胞为纤维化进程细胞，4型和5型细胞为纤维化细胞；建立了一个包含24000张标签图像的数据集，平均分布在六种类型中；以4:1的训练-验证比随机分割数据集，分别得到19200和4800；损失函数选用Softmax_cross_entrophy，优化器选用Adam； 步骤五中，明场数字相差成像方法建立： 该部分，通过比较DPC成像计数法和细胞核荧光标记法，优化了DPC成像的处理参数；然后，使用配备了高分辨率14位电荷耦合器件相机的OperaPhenix高内涵分析系统在10×magnification对每孔进行成像；采用Harmony4.9软件进行分析，其中每孔采集9张图片；一幅图像的分辨率为1360×1024像素，对应的实际物理尺寸为0.88×0.66cm；成像系统产生两通道输出图像，一个通道为明场成像，另一通道为荧光成像；分别在0、12、24和36h比较DPC成像计数和Hoechst33342染色计数；结果表明，两种计数方法无显著性差异；因此，与传统的Hoechst33342细胞核染色法相比，建立的方法不需要进行标记； 与基于靶标的方法相比，表型筛选的一个主要优势是，与疾病相关的蛋白质在自然环境中保持，从而产生更多的生理转译结果；通过Harmony4.9软件进行分析的深度机器反褶积输出DPC成像时的31个细胞形态参数；通过图像形态学的深度分析可以在一次筛选实验中获得更多的参数； 1不同浓度TGF-βI刺激下参数关系： 结果表明，不同浓度的TGF-βI刺激下DPC成像参数和α-SMA荧光成像，细胞面积、细胞圆度、细胞宽度、长度和纵横比呈现相同的趋势；同时，α-SMA的荧光强度随着不同浓度TGF-βI的增加而增加；通过DPC图像分析得到NIH3T3细胞33个形态学参数；通过相关分析，包括CellArea、CellEadialMean在内的24个DPC参数与α-SMA表达具有相关性；2不同时间下DPC参数分析：随后，在相同TGF-βI浓度10ngmL下，不同时间进行DPC成像参数和α-SMA荧光成像；与上述结果一致，DPC成像参数在不同时间α-SMA荧光成像的细胞面积、细胞圆度、细胞宽度、细胞长度和纵横比参数上表现出相同的趋势；α-SMA的表达随着给药时间的延长而增加；后续实验对这些形态学参数和α-SMA荧光强度进行了分析；通过DPC图像分析得到NIH-3T3细胞33个形态学参数；通过相关分析，包括CellArea、CellEadialMean在内的19个DPC参数r20.3与α-SMA表达具有相关性；步骤六中，基于“机器学习”技术辅助的图像分析方法建立，采用Inceptionv4架构的神经网络对图像进行分类；初始输入是一个16位图像，包含一个亮场通道和一个DPC通道；调整原始图像的每个通道的大小并标准化，然后用现有两个通道的平均值生成第三个通道，以形成红-绿-蓝RGB图像，并将299×299×3图像输入到Inceptionv4网络中；将倒数第二个全连通层的输出维数修改为6，将细胞图像分为6种类型；Inceptionv4架构神经网络在ImageNet对象识别数据集上进行了预训练，该数据集包含1000个类别的120万个非单元对象；使用预先训练好的卷积层，将它们与随机初始化的全连接层连接起来，并在构建的数据集上训练得到的网络；以TGF-βI为造模剂，在培养NIH-3t3细胞的孔中加入0.01μM、0.10μM、1μM、5μM、10、20μM不同浓度的TGF-βI处理的细胞分别被标记为1-5型；定义0型和1型细胞为正常细胞，2型和3型细胞为纤维化进程阻滞细胞，4型和5型细胞为纤维化细胞；建立了一个包含24000张标签图像的数据集，平均分布在六种类型中；以4:1的训练-验证比随机分割数据集，分别得到19200和4800；损失函数选用Softmax_cross_entrophy，优化器选用Adam；经过120epoch的训练，网络损失收敛，训练集和验证集的准确率均达到95％；然后，在一个包含4200张标记图像的测试集上测试模型，这些图像独立于由不同操作员进行的训练和验证集；该模型在预测非训练数据时表现出色，计算精度约为92.30％；利用上述机器学习模型对上述1400种化合物的图像进行区分，1400×6孔×9视野＝75600张图像被处理。

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