买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

龙图腾网获悉山东大学申请的专利利用tRNA多个串联sgRNA表达里氏木霉CRISPR/Cas9的建立方法及应用获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN116179544B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2026-03-31发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202211090046.8，技术领域涉及：C12N15/113；该发明授权利用tRNA多个串联sgRNA表达里氏木霉CRISPR/Cas9的建立方法及应用是由钟耀华;张佳欣;栗科航;刘红设计研发完成，并于2022-09-07向国家知识产权局提交的专利申请。

本利用tRNA多个串联sgRNA表达里氏木霉CRISPR/Cas9的建立方法及应用在说明书摘要公布了：本发明提供一种利用tRNA多个串联sgRNA表达里氏木霉CRISPRCas9的建立方法及应用，属于基因工程和生物技术领域。本发明提供一种通过CRISPRCas9利用tRNA‑spacer系统对里氏木霉同时进行多串联sgRNA表达的多基因编辑系统，其中所述tRNA‑spacer系统是以里氏木霉编码甘氨酸的tRNA为间隔sgRNA的方式利用内源tRNA的加工方式从单个转录本释放多个靶向不同位点的sgRNA，继而通过构建同时含有Cas9、sgRNA和筛选标记的自主复制型CRISPRCas9载体，在里氏木霉中建立起精准定位靶向多基因编辑系统的CRISPRCas9技术，具有良好的实际应用之价值。

本发明授权利用tRNA多个串联sgRNA表达里氏木霉CRISPR/Cas9的建立方法及应用在权利要求书中公布了：1.一种利用tRNA多个串联sgRNA表达里氏木霉CRISPRCas9的建立方法，其特征在于，所述建立方法包括： S1、构建含ptrA抗性筛选标记和Cas9表达盒的质粒； S2、设计并合成包含两个靶向cbh1和cbh2的sgRNA表达盒； S3、构建靶向cbh1和cbh2定位敲除的CRISPRCas9载体； S4、构建表达葡萄糖氧化酶的供体DNA融合片段； S5、利用通过CRISPRCas9利用tRNA-spacer系统对里氏木霉同时进行多串联sgRNA表达的多基因编辑系统构建葡萄糖氧化酶表达菌株； 所述步骤S1中，所述质粒具体为pFC33ptrA，其可通过如下方法获得： 将pFC330用引物对Ttef1-DFPmlITtef1-DRptrA扩增Ttef1部分序列；然后用引物对PtrA-FPtrA-RNheI从T-ptrA质粒上扩增ptrA表达盒；最后利用将这两个片段融合得到Ttef1-ptrA；将所述Ttef1-ptrA与pFC330利用PmlI、NheI双酶切，用T4DNA连接酶连接在一起，转化大肠杆菌DH5α，即得； 所述步骤S2中，所述包含两个靶向cbh1和cbh2的sgRNA表达盒具体为5stsgRNAcbh1*2-cbh2*2；其通过如下方法获得：基因合成以如SEQIDNO.2所示的5SrRNA为启动子、包含两个分别靶向cbh1和cbh2的sgRNA、以如SEQIDNO.1所示的里氏木霉编码甘氨酸的tRNA间隔每个sgRNA并以T6为终止子的sgRNA表达盒； 其中，每个sgRNA包含原间隔基序和如SEQIDNO.3所示的支架序列； 所述步骤S3中，构建靶向cbh1和cbh2定位敲除的CRISPRCas9载体具体方法包括：将步骤S1制得的含ptrA抗性筛选标记和Cas9表达盒的质粒与步骤S2制得的包含两个靶向cbh1和cbh2的sgRNA表达盒酶切后连接获得，从而构建含有靶向cbh1和cbh2的sgRNA的CRISPRCas9载体，命名为pFC33ptrA-5stsgRNAcbh1*2-cbh2*2； 所述步骤S4中，构建表达葡萄糖氧化酶的供体DNA融合片段具体方法包括：以里氏木霉Q53G染色体为模板扩增Pcbh1作为上游同源臂；以A.nigerFGX55染色体为模板扩增葡萄糖氧化酶gox基因；以里氏木霉Q53G染色体扩增Tcbh1作为下游同源臂；然后将所扩增的片段融合得到定位表达葡萄糖氧化酶的供体DNA融合片段dGOD-cbh1； 所述里氏木霉Q53G系由里氏木霉QM53菌株经敲除基因pyr4获得； 所述步骤S5中，构建葡萄糖氧化酶表达菌株的具体方法包括：以里氏木霉Q53G为出发菌株；制备里氏木霉Q53G原生质体，然后将步骤S3中获得的pFC33ptrA-5stsgRNAcbh1*2-cbh2*2及步骤S4获得的dGOD-cbh1共转里氏木霉Q53G的原生质体中，经筛选、验证，验证正确的葡萄糖氧化酶菌株，将其命名为QGOX。

如需购买、转让、实施、许可或投资类似专利技术，可联系本专利的申请人或专利权人山东大学，其通讯地址为：266237 山东省青岛市即墨滨海路72号；或者联系龙图腾网官方客服，联系龙图腾网可拨打电话0551-65771310或微信搜索“龙图腾网”。

以上内容由龙图腾AI智能生成。