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龙图腾网获悉中国科学院化学研究所申请的专利一种基于主客体相互作用的纳米孔多肽测序方法获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN119716073B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2026-04-07发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202311271427.0，技术领域涉及：G01N33/68；该发明授权一种基于主客体相互作用的纳米孔多肽测序方法是由吴海臣;伊雅琨;张云;李梓溢设计研发完成，并于2023-09-28向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种基于主客体相互作用的纳米孔多肽测序方法在说明书摘要公布了：本发明公开了一种基于主客体相互作用的纳米孔多肽测序方法。该方法包括下述步骤：1利用蛋白水解酶将待测序的多肽按顺序水解为单体氨基酸；2将单体氨基酸与包含客体分子结构的负载分子之间的连接；3主体分子与客体分子结合后，进行纳米孔单通道记录。本发明提供的是一种从头测序的方法，其利用外肽酶顺序水解多肽的特性获得多肽的序列信息；通过负载分子与单一氨基酸连接的方法，准确的测出了20种编码氨基酸与负载分子结合后产生特征信号的电流阻塞比例，特征电流由单一氨基酸贡献，不存在解码难度；目标多肽用量少，检出限低；实验操作上安全简单，大多数反应在水相中进行，不涉及毒害试剂，绿色安全。

本发明授权一种基于主客体相互作用的纳米孔多肽测序方法在权利要求书中公布了：1.一种基于主客体相互作用的纳米孔多肽测序方法，包括下述步骤：1利用蛋白水解酶将待测序的多肽按顺序水解为单体氨基酸；2将单体氨基酸与包含客体分子结构的负载分子之间的连接；3主体分子与客体分子结合后，进行纳米孔单通道记录； 具体包括下述步骤： 一多肽的酶解： a1：将待测序的多肽充分溶解在酶解缓冲液中，使其终浓度为0.5-20mM之间；所述酶解缓冲液为100mMHEPES，pH7.5； a2：在a1制备的溶液中加入蛋白水解酶，使酶的终浓度在0.1-5.0UmL； a3：将a2混合溶液在37℃孵育2–60分钟，再加入三氟乙酸淬灭，超滤分离得到水解的氨基酸； 二氨基酸与负载分子的偶联： b1：将分离后的氨基酸溶液浓缩，去除溶剂； b2：将待测氨基酸、双功能交联试剂以及有机碱进行反应，形成氨基酸-双功能交联试剂复合物；其中，所述的氨基酸、双功能交联试剂和有机碱的摩尔比为1-100：1：2-10，所述反应的时间为1-4h；所述双功能交联试剂以DMF溶液的形式加入，所述有机碱以DMF溶液的形式加入； b3：将所述氨基酸-双功能交联试剂复合物与负载分子反应，得到待测氨基酸分子-负载分子复合探针；其中，所述氨基酸-双功能交联试剂复合物与负载分子的摩尔比为1-100：1，所述反应为常温反应1-8h；所述负载分子以水溶液的形式加入； 所述有机碱选自TEA，NMM，DIPEA，Py，DBU，咪唑、NMI中的至少一种； 三纳米孔单通道记录： c1：使用二植酰磷脂酰胆碱用于在25微米厚的聚四氟乙烯薄膜上形成直径为100-150微米的合成脂质双分子层； c2：将纳米孔嵌入磷脂双分子层中，磷脂双分子层将样品池分为顺式和反式两个腔室，两个腔室都含有1.0mL缓冲溶液；将所述待测氨基酸分子-负载分子复合探针添加到顺式腔室中，同时向顺式腔室中加入主体分子； 上述实验在pH值为5.0–8.0的条件下、温度为25.0±3.0℃的0.8–4.0MKCl、10mM柠檬酸缓冲液中进行； 所述主体分子物质量相对所述待测氨基酸分子-负载分子复合探针物质量过量10倍以上； c3：向纳米孔单通道测试系统施加+80～250mV范围中的一个固定偏置电压并记录，负载分子与主体分子在主客体相互作用以及电泳力的驱动下向纳米孔移动，产生特征电流信号；信号采样频率为100kHz，Bessel低通滤波截至频率为10kHz； 四数据处理及分析： d1：使用Clampfit软件中的Single-ChannelSearch功能对记录的数据进行扫描，提取每一个特征电流阻滞幅度和阻滞时间长度信息； d2：根据基线电流计算相应信号的电流阻滞比例； d3：将得到的数据导入Origin软件，绘制信号阻滞时间长度-电流阻滞比例图，并对信号电流阻滞比例做频数分析； d4：按电流阻滞比例频数从高到底的顺序确定氨基酸被水解的先后，并依据使用蛋白酶的种类确定多肽序列； 所述步骤2中，所述负载分子包括客体分子结构、连接功能结构域以及牵引序列的组合； 所述客体分子结构选自二茂铁及其衍生物，金刚烷及其衍生物，苯丙氨酸及其衍生物，酪氨酸及其衍生物，组氨酸及其衍生物，甲硫氨酸及其衍生物中的至少一种； 所述连接功能结构域选自叠氮基、酰卤、炔基、烯丙基、巯基、氨基、琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺酯中的至少一种； 所述牵引序列选自聚电解质。

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