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龙图腾网获悉湖南大地同年生物科技有限公司申请的专利多重PCR检测反应中代替高温变性产生单链的方法和提高多重PCR产物液相杂交检测灵敏性和准确性的方法及配套的试剂盒获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN120138110B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2026-04-07发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202510304226.9，技术领域涉及：C12Q1/6816；该发明授权多重PCR检测反应中代替高温变性产生单链的方法和提高多重PCR产物液相杂交检测灵敏性和准确性的方法及配套的试剂盒是由邓春明;周巧;鞠巍;谢心悦;徐根明设计研发完成，并于2025-03-14向国家知识产权局提交的专利申请。

本多重PCR检测反应中代替高温变性产生单链的方法和提高多重PCR产物液相杂交检测灵敏性和准确性的方法及配套的试剂盒在说明书摘要公布了：本发明公开了一种多重PCR检测反应中代替高温变性产生单链的方法和提高多重PCR产物液相杂交检测灵敏性和准确性的方法及配套的试剂盒。主要通过一条引物5’端设计修饰带有磷酸基团，从而扩增出其中一条链的一端磷酸化的PCR产物；将PCR扩增产物用Lambda核酸外切酶进行消化处理，完全去掉一端带有磷酸化的DNA链，得到单链。本发明代替普通多重PCR检测反应高温变性产生单链的方法，消除了DNA复性对探针与靶序列杂交的负面影响，提升杂交效率，提高了液体芯片技术平台在应用分子检测应用中的准确性和灵敏性。

本发明授权多重PCR检测反应中代替高温变性产生单链的方法和提高多重PCR产物液相杂交检测灵敏性和准确性的方法及配套的试剂盒在权利要求书中公布了：1.一种提高多重PCR产物液相杂交检测灵敏性和准确性的检测引物在制备检测试剂盒中的应用，其特征在于，包括以下步骤： 1获得单链； 2根据多重PCR靶标序列和引物扩增区域设计对应的特异性探针，所述的特异性探针序列在上下游引物扩增范围之内,5’端带有NH2修饰； 3将特异性探针耦合到带有唯一编码的磁珠上； 4单链与对应编码的耦合上特异性探针的磁珠混合进行杂交反应； 5分析检测结果； 步骤1获得单链的方式如下： 在多重PCR特异性引物的5’端添加一段通用序列，再设计一对3’端部分序列与所述通用序列互补的通用引物，所述通用引物的一条引物5’端带有磷酸基团修饰，利用特异性引物和通用引物一起扩增出其中一条链的一端磷酸化的PCR产物； 酶切反应体系酶量1μL，反应时间30min，反应体积25μL； 用于同时检测：PIK3CA，NRG1，VHL，EGFR，ERBB2，PDGFRA，BRAF和CEACAM5基因； 通用引物序列：UP-F：TACGACTTCGTCCGAGACACTGACTAGGG，5’-Biotin； UP-R：GAAGGTGCGACATAACACGTAAGTTCAGCT，5’-P； 针对PIK3CA的引物、探针序列如下： PIK3CA-F1-T： TACGACTTCGTCCGAGACACTGACTAGGGTGGAATGATAGTGACTTTAGAATGCC， PIK3CA-R1-T：GAAGGTGCGACATAACACGTAAGTTCAGCTATCTTGAAGAAGTTGATGGAGGG； PIK3CA-P探针：TTTTTTTTTATTTTTTTTTGTTCATGCTTTATGGTTATTAATGTAGCCTC，5’-NH2； 针对NRG1的引物、探针序列如下： NRG1-F1-T：TACGACTTCGTCCGAGACACTGACTAGGGTTTCCGAAAGCCACTCTGTAATC； NRG1-R1-T：GAAGGTGCGACATAACACGTAAGTTCAGCTGCATGCCTGAGGAAGCTGTTAC； NRG1-P探针：TTTTTTTTTATTTTTTTTTAGTTGGGCTGCTGTGCCTACTGTTTTCTACGG，5’-NH2； 针对VHL的引物、探针序列如下： VHL-F1-T：TACGACTTCGTCCGAGACACTGACTAGGGAGTTCTGCGTAGTCCCTGCC； VHL-R1-T：GAAGGTGCGACATAACACGTAAGTTCAGCTACACACGGTCGGCTCTTCC； VHL-P探针：TTTTTTTTTATTTTTTTTTTTGCATCTGTCAGTCTCCCCAGGAGGAATG，5’-NH2； 针对EGFR的引物、探针序列如下： EGFR-F1-T：TACGACTTCGTCCGAGACACTGACTAGGGCTCAACACAGTGGAGCGAATTC； EGFR-R1-T：GAAGGTGCGACATAACACGTAAGTTCAGCTTTCAGTCCGGTTTTATTTGCATC； EGFR-P探针：TTTTTTTTTATTTTTTTTTACATATTTCCTCTGATGATCTGCAGGTTTTCC，5’-NH2； 针对ERBB2的引物、探针序列如下： ERBB2-F1-T：TACGACTTCGTCCGAGACACTGACTAGGGCGTGCTCATCGCTCACAACC； ERBB2-R3-T：GAAGGTGCGACATAACACGTAAGTTCAGCTTGAGGCTTCGAAGCTGCAG； ERBB2-P探针：TTTTTTTTTATTTTTTTTTCCTCAAAGAGCTGGGTGCCTCGCACAATCC，5’-NH2； 针对PDGFRA的引物、探针序列如下： PDGFRA-F1-T：TACGACTTCGTCCGAGACACTGACTAGGGGGTTGTGCAGCTGAATTCATCC； PDGFRA-R1-T： GAAGGTGCGACATAACACGTAAGTTCAGCTTTGTTTTCTTCATTTCTGATTTCCAC； PDGFRA-P探针：TTTTTTTTTATTTTTTTTTAGCTCACTTCACTCTCCCCAAAGCATCTCAG；5’-NH2； 针对BRAF的引物、探针序列如下： BRAF-F1-T：TACGACTTCGTCCGAGACACTGACTAGGGCAGCAAGCTAGATGCACTCCAAC； BRAF-R1-T： GAAGGTGCGACATAACACGTAAGTTCAGCTTGAAAGGCTAGAAGAGGAAGAAGATG； BRAF-P探针：TTTTTTTTTATTTTTTTTTTAGAAACAGAAAAATCAGTTCCGTTCCCCAGA，5’-NH2； 针对CEACAM5的引物、探针序列如下： CEACAM5-F1-T：TACGACTTCGTCCGAGACACTGACTAGGGGTGAAAGAGTGGATGGCAACC； CEACAM5-R1-T：GAAGGTGCGACATAACACGTAAGTTCAGCTGATCAGCAGGGATGCATTGG； CEACAM5-P探针：TTTTTTTTTATTTTTTTTTGGGTAGCTTGTTGAGTTCCTATTACATATCC，5’-NH2； 样本杂交反应 1将EGFR，PIK3CA,NRG1,VHL,ERBB2,PDGFRA,BRAF和CEACAM5对应的磁珠和空白磁珠混合，补杂交缓冲液至每反应管45μL，置于超级恒温混匀仪以转速1600rpm于杂交温度反应5分钟； 2后在反应管中逐个加入5μL酶切后待检测核酸样本，于超级恒温混匀仪上以转速1600rpm于杂交温度进行杂交反应20分钟； 3杂交反应完成后，将反应管置于磁力架上，静置2分钟后，缓慢移除上清液，加入50μL5μgmLSA-PE溶液至反应管中，并置于超级恒温混匀仪，以室温1600rpm反应15分钟进行染色反应； 4染色反应后，将反应管置于磁力架2分钟，吸除上清液后加入150μL1xPBS-T，于超级恒温混匀仪以室温转速1600rpm,反应30秒进行清洗，重复两次； 5每个反应管分别加入200μL检测缓冲液，反复吸打至少10次使磁珠均匀分布，用荧光定量分析仪进行结果检测。

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