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龙图腾网获悉广州立白企业集团有限公司申请的专利一种构建多基因改造酵母菌的方法及其应用获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN117511986B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2026-04-10发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202311347892.8，技术领域涉及：C12N15/81；该发明授权一种构建多基因改造酵母菌的方法及其应用是由张迷敏;刘杰;张利萍设计研发完成，并于2023-10-17向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种构建多基因改造酵母菌的方法及其应用在说明书摘要公布了：本发明公开了一种高效构建多基因改造酵母菌的方法及其应用。该方法通过两步法融合PCR及巢氏PCR构建得到长度达8000bp以上的长双链DNA目标载体，并将其单链化为长单链DNA目标载体，从而高效成功转化酵母菌，大大缩短了构建载体所需时间，提高了长链DNA转化酵母菌体的成功率和酵母菌的改造效率，步骤简单易操作、耗时短、载体转化效率高，成本低，可广泛用于酵母菌的多基因改造。本发明利用该方法构建了敲除MFO‑2基因并过表达MRD‑2和pUGTB基因的多基因改造熊蜂生假丝酵母菌，其与野生型相比可在更短时间内发酵生成等量的槐糖脂，有利于在实际生产中缩短发酵用时，节省能耗，提高槐糖脂的发酵效率。

本发明授权一种构建多基因改造酵母菌的方法及其应用在权利要求书中公布了：1.一种构建多基因改造酵母菌的方法，其特征在于，以熊蜂生假丝酵母菌为出发菌株，所述改造包括基因的敲除及过表达；所述方法包括以下步骤： S1.确定待敲除基因、一个或若干个待过表达基因；以待敲除基因的上游同源臂作为第一个DNA片段，以待敲除基因的下游同源臂作为最后一个DNA片段，所述一个或若干个待过表达基因为依次连接在所述第一个DNA片段和最后一个DNA片段中间的DNA片段； 所述待敲除基因为MFO-2基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述MFO-2基因的上游同源臂MFO-2-5’的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述MFO-2基因的下游同源臂MFO-2-3’的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述待过表达基因为gF-Hph-gR、MRD-2和pUGTB基因，gF-Hph-gR基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，MRD-2基因的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，pUGTB基因的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示； S2.制备S1所述的所有DNA片段，通过两步法融合PCR和巢氏PCR将所有DNA片段连接成用于多基因改造的长双链DNA目标载体；所述两步法融合PCR的反应程序中的延伸时间以酶反应速率为30～60secKb计算； 所述的所有DNA片段进行融合PCR时的连接顺序为MFO2基因的上游同源臂+pUGTB基因+gF-Hph-gR基因+MRD2基因+MFO2基因的下游同源臂；进行融合PCR时，通过同源重组将MFO-2-5’、pUGTB、gF-Hph-gR、MRD-2和MFO-2-3’进行融合；其中，MFO-2-5’和pUGTB利用同源序列MF-U进行同源重组，pUGTB和gF-Hph-gR利用同源序列U-H进行同源重组，gF-Hph-gR和MRD-2利用同源序列H-MR进行同源重组，MRD-2和MFO-2-3’利用同源序列MR-MF进行同源重组； MF-U：CAAGAAGGGAAAGTGAAACCAGAGAGTGGGACCTGATTC； U-H：AGGTAGATAGATACACGTTTTTAGACGTGCATACATGCGAGT； H-MR：AGCGACGCACGATCCAATACATGGTGGATGATATACAGGTA； MR-MF：CATTTAGCGAGCCACAAGTGAACACCAAAGCCATTACTGC； S3.将S2所得长双链DNA目标载体单链化为长单链DNA目标载体并转化酵母菌感受态细胞，筛选阳性转化子。

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